Anioninvaihtokromatografia - Anion-exchange chromatography

Anioninvaihtokromatografia on prosessi, joka erottaa aineet niiden varausten perusteella käyttämällä ioninvaihtohartsia, joka sisältää positiivisesti varautuneita ryhmiä, kuten dietyyliaminoetyyliryhmiä (DEAE). Liuoksessa hartsi on päällystetty positiivisesti varautuneilla vastaioneilla ( kationeilla ). Anioninvaihtohartsit sitoutuvat negatiivisesti varautuneisiin molekyyleihin syrjäyttäen vastaionin. Anioninvaihtokromatografiaa käytetään yleisesti proteiinien , aminohappojen , sokerien / hiilihydraattien ja muiden happamien aineiden puhdistamiseen negatiivisella varauksella korkeammilla pH- tasoilla. Sidoksen tiiviys aineen ja hartsin välillä perustuu aineen negatiivisen varauksen voimakkuuteen.

Yleinen tekniikka proteiinien puhdistamiseksi

Pylvääseen kaadetaan hartsiliete, kuten DEAE-Sephadex. Käytetty matriisi on liukenematon kovalenttisesti kiinnittyneisiin varautuneisiin ryhmiin. Näitä varattuja ryhmiä kutsutaan vaihtimiksi, kuten kationiksi ja anioninvaihtajiksi. Kun se on laskeutunut, kolonni tasapainotetaan puskurissa ennen proteiiniseoksen levittämistä. DEAE-Sephadex on positiivisesti varautunut liete, jolla on sähköstaattisia vuorovaikutuksia negatiivisesti varautuneiden atomien kanssa, jolloin ne eluoituvat myöhemmin kuin kiinnostuneen näytteen positiivisesti varautuneet molekyylit. Tämä on erotustekniikka, jota käytetään laajasti spesifisten proteiinien tai entsyymien löytämiseen kehosta. Sitoutumattomat proteiinit kerätään läpivirtauksessa ja / tai myöhemmissä puskuripesuissa. Proteiinit, jotka sitoutuvat positiivisesti varautuneeseen hartsiin, pidätetään ja ne voidaan eluoida kahdella tavalla. Ensinnäkin suolapitoisuutta eluutiopuskurissa nostetaan vähitellen. Suolaliuoksen negatiiviset ionit (esim. Cl ^- ) kilpailevat proteiinin kanssa sitoutuessaan hartsiin. Toiseksi liuoksen pH : ta voidaan vähitellen laskea, mikä johtaa positiivisempaan varaukseen proteiinissa vapauttaen sen hartsista. Molemmat näistä tekniikoista voivat syrjäyttää negatiivisesti varautuneen proteiinin, joka sitten eluoituu puskurilla koeputkijakeiksi.

Proteiinien erottaminen riippuu kokonaispanoksen eroista. Ionisoitavien sivuketjuryhmien koostumus määrittää proteiinin kokonaispanoksen tietyssä pH: ssa . On isoelektrinen piste (pl) , kokonaisvaraus proteiinin on 0, ja se ei sitoudu matriisiin. Jos pH on pl: n yläpuolella, proteiinilla on negatiivinen varaus ja se sitoutuu matriisiin anioninvaihtokolonnissa. Proteiinin stabiilisuus pi: n ylä- tai alapuolella olevissa arvoissa määrää, pitäisikö käyttää anioninvaihtopylvästä vai kationinvaihtokolonnia. Jos se on stabiili pH-arvoissa alle pl, käytetään kationinvaihtopylvästä. Jos se on stabiili pH-arvoissa pl: n yläpuolella, voidaan käyttää anioninvaihtokolonnia.

Viitteet