Siirtokromatografia - Displacement chromatography
Siirtokromatografia on kromatografiatekniikka , jossa näyte asetetaan pylvään päähän ja syrjäytetään sitten liuenneella aineella, joka on sorboitunut voimakkaammin kuin alkuperäisen seoksen komponentit. Tuloksena on, että komponentit hajotetaan peräkkäisiksi "suorakulmaisiksi" alueiksi, joissa on erittäin väkevöityjä puhtaita aineita, eikä liuottimilla erotettuja "piikkejä". Se on ensisijaisesti valmisteleva tekniikka; korkeampi tuotekonsentraatio, suurempi puhtaus ja lisääntynyt läpäisykyky voidaan saavuttaa muihin kromatografiatapoihin verrattuna.
Löytö
Siirtymäkromatografian kynnys voidaan katsoa johtuvan Arne Tiseliusista , joka vuonna 1943 luokitteli ensin kromatografiatilat edestä, eluutiosta ja siirtymästä. Siirtokromatografialla löydettiin erilaisia sovelluksia, mukaan lukien transuraanisten alkuaineiden ja biokemiallisten kokonaisuuksien eristäminen . Tekniikan kehitti Csaba Horváth , joka käytti moderneja korkeapaineisia pylväitä ja laitteita. Sittemmin se on löytänyt monia sovelluksia, erityisesti biologisen makromolekyylipuhdistuksen alalla.
Periaate
Siirtokromatografian perusperiaate on: matriisissa (kiinteä faasi) on vain rajallinen määrä liuenneiden aineiden sitoutumiskohtia, ja jos yksi molekyyli vie paikan, se ei ole muiden käytettävissä. Kuten missä tahansa kromatografiassa, matriisiin sitoutuneiden tietyn tyyppisten molekyylien ja liuoksessa vapaiden samanlaisten molekyylien välillä on tasapaino. Koska sitoutumiskohtien lukumäärä on rajallinen, kun liuoksessa vapaiden molekyylien pitoisuus on suuri suhteessa kohtien dissosiaatiovakioon , nämä kohdat täyttyvät enimmäkseen. Tämä johtaa alaspäin osoittavaan kaarevuuteen sitoutuneen tai vapaan liuenneen aineen käyrässä, yksinkertaisimmassa tapauksessa antaen Langmuir-isotermin . Molekyyli, jolla on suuri affiniteetti matriisiin (syrjäyttimeen), kilpailee tehokkaammin sitoutumiskohdista, jättäen liikkuvan faasin rikastuneena matalan affiniteetin liuenneeseen aineeseen. Liikkuvan faasin virtaus pylvään läpi kuljettaa ensisijaisesti matalamman affiniteetin liuenneen aineen ja siten korkealla konsentraatiolla korkeamman affiniteetin omaava aine lopulta syrjäyttää kaikki molekyylit, joilla on vähemmän affiniteetteja.
Toimintamalli
Ladataan
Ajon alussa kolonniin levitetään erotettavien liuenneiden aineiden seos olosuhteissa, jotka on valittu edistämään korkeaa retentioa. Suuremman affiniteetin liuenneet aineet pidetään ensisijaisesti kolonnin pään lähellä, kun matalamman affiniteetin liuenneet aineet liikkuvat kauempana alavirtaan. Nopeimmin liikkuva komponentti alkaa muodostaa puhtaan vyöhykkeen alavirtaan. Myös muut komponentit alkavat muodostaa vyöhykkeitä, mutta sekarehun jatkuva syöttö pylvään kärjessä estää täydellisen erottelun.
Siirtymä
Kun koko näyte on ladattu, syöttö kytketään siirtolaitteeseen, jolla on suurempi affiniteetti kuin millään näytekomponentilla. Siirtolaite muodostaa terävän reunan pylvään kärkeen työntämällä muut komponentit alavirtaan. Jokainen näytekomponentti toimii nyt syrjäyttimenä matalamman affiniteetin omaaville aineille, ja liuenneet aineet lajittelevat itsensä vierekkäisiksi kaistoiksi ("siirtojuna"), jotka kaikki liikkuvat alavirtaan syrjäyttimen asettamalla nopeudella. Pylvään koko ja kuormitus valitaan, jotta tämä lajitteluprosessi saadaan päätökseen ennen kuin komponentit saavuttavat sarakkeen pohjan. Liuenneet aineet näkyvät pylvään alaosassa vierekkäisten vyöhykkeiden sarjana, joista jokainen koostuu yhdestä puhdistetusta komponentista, ja pitoisuus kussakin yksittäisessä vyöhykkeessä on tosiasiallisesti tasainen.
Regenerointi
Viimeisen liuenneen aineen eluoitumisen jälkeen on välttämätöntä irrottaa siirtolaite kolonnista. Koska syrjäytin valittiin suuren affiniteetin vuoksi, tämä voi aiheuttaa haasteen. Käänteisfaasimateriaaleilla voi riittää pesu suurella prosenttiosalla orgaanista liuotinta. Usein käytetään myös suuria pH-muutoksia. Yksi tehokas strategia on syrjäyttimen poistaminen kemiallisella reaktiolla; esimerkiksi jos vetyionia käytettiin syrjäyttimenä, se voidaan poistaa reaktiolla hydroksidin kanssa tai moniarvoinen metalli-ioni voidaan poistaa reagoimalla kelatoivan aineen kanssa. Joillekin matriiseille kiinteän faasin reaktiiviset ryhmät voidaan titrata sitoutumiskohtien väliaikaiseksi eliminoimiseksi, esimerkiksi heikkohappoiset ioninvaihtimet tai kelatoivat hartsit voidaan muuntaa protonoituun muotoon. Geelityyppisille ioninvaihtimille selektiivisyyden vaihtaminen erittäin suurella ionivahvuudella voi myös tarjota ratkaisun. Joskus syrjäytyslaite on erityisesti suunniteltu titrat- tavalla toiminnallisella ryhmällä affiniteetinsa muuttamiseksi. Kun siirtolaite on pesty pois, pylväs pestään tarpeen mukaan sen palauttamiseksi alkuperäiseen tilaan seuraavaa ajoa varten.
Vertailu eluutiokromatografiaan
Yhteiset perusteet
Missä tahansa kromatografiamuodossa nopeus, jolla liuotettu aine liikkuu pylväästä alaspäin, heijastaa suoraan sen ajan prosenttiosuutta, jonka liuotettava aine viettää liikkuvassa faasissa. Erotuksen saavuttamiseksi joko eluutiolla tai syrjäytyskromatografialla on oltava huomattavia eroja vastaavien liuenneiden aineiden affiniteetissa paikallaan olevaan faasiin. Molemmat menetelmät tukeutuvat liikkeeseen pylväästä alas vahvistaakseen pienten jakautumiserojen vaikutusta kahden vaiheen välillä. Jakautumista liikkuvan ja paikallaan olevan vaiheen välillä kuvaa sitoutumisisotermi, juokseva liuos, joka on sitoutunut paikalliseen vaiheeseen (tai jakautunut siihen) liikkuvan faasin pitoisuuden funktiona. Isotermi on usein lineaarinen tai suunnilleen niin pienillä pitoisuuksilla, mutta yleensä käyrät (koverat - alaspäin) suuremmilla pitoisuuksilla, kun paikallaan oleva faasi kyllästyy.
Eluutiomoodin ominaisuudet
Eluutiomoodissa liuenneita aineita levitetään pylvääseen kapeina kaistoina ja matalalla konsentraatiolla ne liikkuvat pylväästä alaspäin suunnilleen Gaussin huippuina. Nämä huiput laajenevat edelleen matkan aikana suhteessa kuljetun matkan neliöjuureen. Jotta kaksi ainetta hajoaisi, niiden on kulkeuduttava pylväästä alas riittävän erilaisella nopeudella kaistanleviämisen vaikutusten voittamiseksi. Suurella pitoisuudella toimiminen, jossa isotermi on kaareva, on epäedullista eluutiokromatografiassa, koska kulkunopeus riippuu sitten konsentraatiosta, jolloin piikit leviävät ja vääristyvät.
Retentio eluutiokromatografiassa kontrolloidaan yleensä säätämällä liikkuvan faasin koostumus (liuotinkoostumuksen, pH: n, ionivahvuuden ja niin edelleen) käytetyn paikallaan olevan faasin tyypin ja eroteltavien liuenneiden aineiden mukaan. Liikkuvien faasikomponenttien affiniteetti paikallaan olevaan faasiin on yleensä matalampi kuin erotetuilla liuenneilla aineilla, mutta niitä on läsnä korkeammilla pitoisuuksilla ja ne saavuttavat vaikutuksensa massan vaikutuksesta . Erottuminen eluutiokromatografiassa on yleensä parempi, kun piikit pysyvät voimakkaasti, mutta olosuhteet, jotka antavat hyvien varhaispiikkien erotuskyvyn, johtavat pitkiin käyttöaikoihin ja myöhempien piikkien liialliseen laajentumiseen, ellei käytetä gradienttieluutiota . Kaltevuuslaitteet lisäävät monimutkaisuutta ja kustannuksia etenkin suuressa mittakaavassa.
Siirtotilan edut ja haitat
Toisin kuin eluutiokromatografia, syrjäytystilassa erotetut liuenneet aineet muodostavat teräväreunaisia alueita pikemminkin kuin levittävät piikit. Vyöhykerajat siirtokromatografiassa ovat itsestään teräviä: jos molekyyli jostakin syystä saavuttaa kaistansa, se tulee vyöhykkeelle, jossa se pysyy voimakkaammin, ja kulkee sitten hitaammin, kunnes vyöhyke tarttuu kiinni. Lisäksi koska siirtokromatografia hyödyntää isotermien epälineaarisuutta, kuormitukset ovat tarkoituksella suuria; enemmän materiaalia voidaan erottaa tietyssä pylväässä tiettynä aikana puhdistettujen komponenttien talteen otettua merkittävästi suuremmilla pitoisuuksilla. Retentio-olosuhteita voidaan edelleen säätää, mutta syrjäytyslaite ohjaa liuenneiden aineiden siirtymisnopeutta. Siirtolaitteella valitaan olevan suurempi affiniteetti paikallaan olevaan faasiin kuin jollakin erotettavalla liuenneella aineella, ja sen konsentraatio asetetaan lähentämään paikallaan olevan faasin kylläisyyttä ja antamaan haluttu konsentraatioaallon siirtymisnopeus. Suuria retentio-olosuhteita voidaan käyttää ilman kaltevuuskäyttöä, koska siirtolaite varmistaa kaikkien mielenkiinnon kohteena olevien liuenneiden aineiden poistamisen suunnitellulla ajoajalla.
Koska pylväs kuormitetaan voimakkaasti retentio-olosuhteissa, siirtokromatografia soveltuu hyvin komponenttien puhdistamiseen laimennetuista syöttövirroista. On kuitenkin myös mahdollista konsentroida materiaali laimennetusta virrasta kromatografiakolonnin kärjessä ja sitten vaihtaa olosuhteita adsorboidun materiaalin eluoimiseksi tavanomaisissa isokraattisissa tai gradienttimoodeissa. Siksi tämä lähestymistapa ei ole ainutlaatuinen siirtokromatografialle, vaikka suurempi kuormituskapasiteetti ja vähemmän laimennusta mahdollistavat suuremman konsentraation siirtomoodissa.
Siirtokromatografian haittana on, että epäideaalisuuksista syntyy aina päällekkäinen alue kunkin komponenttiparin välillä; tämä sekoitettu alue on kerättävä erikseen kierrätystä tai hävittämistä varten erotettujen materiaalien puhtauden säilyttämiseksi. Strategiaa lisätä välimolekyylejä komponenttien välisten vyöhykkeiden muodostamiseksi (joskus kutsutaan "kantajan siirtokromatografiaksi") on tutkittu, ja se voi olla hyödyllinen, kun löytyy sopivia, helposti irrotettavia välikappaleita. Toinen haittapuoli on, että raakakromatogrammia, esimerkiksi absorbanssin tai taitekertoimen käyrä vs. eluutiotilavuus, voi olla vaikea tulkita vierekkäisille alueille, varsinkin jos siirtojuna ei ole täysin kehittynyt. Dokumentaatio ja vianmääritys voivat vaatia ylimääräisiä kemiallisia analyyseja tietyn komponentin jakauman määrittämiseksi. Toinen haitta on, että regeneraatioon tarvittava aika rajoittaa läpimenoa.
John C.Fordin artikkelin Encyclopedia of Chromatography mukaan teoreettiset tutkimukset osoittavat, että ainakin joissakin järjestelmissä optimoitu ylikuormitettu eluutiokromatografia tarjoaa korkeamman suorituskyvyn kuin siirtokromatografia, vaikka rajoitetut kokeelliset testit viittaavat siihen, että siirtokromatografia on parempi (ainakin ennen regenerointiaika).
Sovellukset
Historiallisesti siirtokromatografiaa käytettiin aminohappojen ja harvinaisten maametallien alkuaineiden preparatiivisiin erotteluihin, ja sitä on tutkittu myös isotooppierotukselle.
Proteiinit
Proteiinien kromatografinen puhdistus monimutkaisista seoksista voi olla varsin haastavaa, varsinkin kun seokset sisältävät samalla tavalla pidätettyjä proteiineja tai kun halutaan rikastaa hivenaineita rehussa. Lisäksi pylvään kuormitusta rajoitetaan usein, kun vaaditaan suuria erottelutarkoituksia käyttämällä perinteisiä kromatografiatapoja (esim. Lineaarinen gradientti, isokraattinen kromatografia). Näissä tapauksissa syrjäytyskromatografia on tehokas tekniikka proteiinien puhdistamiseksi monimutkaisista seoksista korkeilla kolonnikuormituksilla monissa sovelluksissa.
Tärkeä edistysaskel siirtokromatografian alalla oli pienimolekyylisten massansiirtimien kehittäminen proteiinien puhdistamiseksi ioninvaihtojärjestelmissä. Tämä tutkimus oli merkittävä siinä mielessä, että se edusti merkittävästi poikkeamista tavanomaisesta viisaudesta, jonka mukaan proteiinien syrjäyttämiseksi ioninvaihtojärjestelmissä vaaditaan suuria polyelektrolyyttipolymeerejä .
Pienimolekyylipainoisilla syrjäyttimillä on merkittäviä toiminnallisia etuja verrattuna suuriin polyelektrolyyttien syrjäyttimiin. Esimerkiksi, jos syrjäyttimen ja kiinnostuksen kohteena olevan proteiinin välillä on päällekkäisyyksiä, nämä pienimolekyyliset materiaalit voidaan helposti erottaa puhdistetusta proteiinista syrjäyttämisen jälkeisessä prosessoinnissa käyttämällä vakiokokoon perustuvia puhdistusmenetelmiä (esim. Koon poissulkemiskromatografia , ultrasuodatus ) . Lisäksi näiden pienen MW: n syrjäyttimien suolasta riippuvainen adsorptiokäyttäytyminen helpottaa suuresti kolonnin regeneroitumista. Näitä syrjäyttimiä on käytetty monenlaisiin korkean resoluution erotteluihin ioninvaihtojärjestelmissä. Lisäksi syrjäytyskromatografian hyödyllisyys rekombinanttien kasvutekijöiden , antigeenisten rokoteproteiinien ja antisense-oligonukleotidien puhdistamiseksi on myös osoitettu. On olemassa useita esimerkkejä, joissa siirtokromatografiaa on sovellettu proteiinien puhdistamiseen käyttäen ioninvaihtoa , hydrofobista vuorovaikutusta sekä käänteisfaasikromatografiaa .
Siirtokromatografia soveltuu hyvin puhdistettujen proteiinien mg-määrien saamiseen monimutkaisista seoksista käyttämällä standardinmukaisia analyyttisiä kromatografiapylväitä penkkiasteikossa. Se soveltuu erityisen hyvin myös rehujen hivenaineiden rikastamiseen. Siirtokromatografia voidaan helposti suorittaa käyttämällä erilaisia hartsijärjestelmiä, mukaan lukien ioninvaihto, HIC ja RPLC
Kaksiulotteinen kromatografia
Kaksiulotteinen kromatografia edustaa perusteellisinta ja tarkinta lähestymistapaa proteomin arviointiin . Vaikka aiemmin hyväksytyissä lähestymistavoissa on käytetty eluutiomoodikromatografisia lähestymistapoja, kuten kationinvaihto käänteisfaasi- HPLC: hen , saannot ovat tyypillisesti hyvin pieniä, mikä edellyttää analyyttistä herkkyyttä pikomolaarisesta femtomolaariseen alueeseen. Koska siirtokromatografia tarjoaa etun hivekomponenttien konsentroinnille, kaksiulotteinen kromatografia, joka käyttää siirtymää pikemminkin kuin eluutiomoodia ylävirran kromatografiavaiheessa, on potentiaalinen työkalu hivenaineiden analysointiin, modifikaatioihin ja proteomin pienten ekspressoitujen komponenttien tunnistamiseen.