DNA -mikrosarja - DNA microarray

Mikrotason käyttäminen genotyypin määrittämiseen. Videolla esitetään prosessi, jolla genotyypit poimitaan ihmisen syljenäytteestä mikrokaavioiden avulla. Genotyypitys on merkittävä DNA -mikropiirien käyttö, mutta tietyin muutoksin niitä voidaan käyttää myös muihin tarkoituksiin, kuten geeniekspression ja epigeneettisten merkkiaineiden mittaamiseen.

DNA-mikrosiru (myös yleisesti tunnettu DNA- sirun tai biosiru ) on kokoelma mikroskooppisen DNA-paikkoja on kiinnitetty kiinteään pintaan. Tutkijat käyttävät DNA- mikrosiruja mitata ilmentymisen tasojen suuri määrä geenejä samanaikaisesti tai genotyyppiin useita alueita genomin. Kukin DNA paikka sisältää pikomoolia (10 -12 mol ), joka on spesifisen DNA-sekvenssin, joka tunnetaan nimellä koettimina (tai toimittajat tai oligot ). Nämä voivat olla lyhyt osa geenin tai muun DNA-elementti, joita käytetään hybridisoitumaan cDNA tai cRNA-(kutsutaan myös anti-sense-RNA: n) näyte (kutsutaan kohde ) korkean ankaruuden olosuhteissa. Koettimen kohde -hybridisaatio havaitaan ja kvantifioidaan yleensä havaitsemalla fluorofori- , hopea- tai kemiluminesenssileimatut kohteet, jotta voidaan määrittää kohteen nukleiinihapposekvenssien suhteellinen runsaus. Alkuperäiset nukleiinihappomatriisit olivat noin 9 cm × 12 cm: n makromatriiseja ja ensimmäinen tietokonepohjainen kuvapohjainen analyysi julkaistiin vuonna 1981. Sen keksi Patrick O. Brown . Esimerkki sen sovelluksesta on SNP -matriiseissa, jotka koskevat sydän- ja verisuonitautien, syövän, taudinaiheuttajien ja GWAS -analyysin polymorfismeja. Myös rakenteellisten vaihtelujen tunnistamiseen ja geeniekspression mittaamiseen.

Periaate

Kohteen hybridisointi koettimeen

Mikropiirien taustalla oleva perusperiaate on kahden DNA -juosteen välinen hybridisaatio, joka on komplementaaristen nukleiinihapposekvenssien ominaisuus muodostaa pariliitos spesifisesti toistensa kanssa muodostamalla vetysidoksia komplementaaristen nukleotidiemäsparien välille . Suuri määrä komplementaarisia emäspareja nukleotidisekvenssissä tarkoittaa tiukempaa ei-kovalenttista sidosta kahden juosteen välillä. Epäspesifisten sidossekvenssien pesun jälkeen vain vahvasti pariksi muodostuneet säikeet jäävät hybridisoituneiksi. Fluoresoivasti leimatut kohdesekvenssit, jotka sitoutuvat koettimen sekvenssiin, muodostavat signaalin, joka riippuu hybridisaatio -olosuhteista (kuten lämpötilasta) ja pesusta hybridisaation jälkeen. Signaalin kokonaisvoimakkuus pisteestä (ominaisuus) riippuu kohdenäytteen sitoutumisen määrästä paikalla oleviin koettimiin. Mikrosarjat käyttävät suhteellista kvantitointia, jossa ominaisuuden voimakkuutta verrataan saman ominaisuuden intensiteettiin eri olosuhteissa, ja ominaisuuden identiteetti tunnetaan sen sijainnista.

Microarray -kokeessa tarvittavat vaiheet

Käyttötarkoitukset ja tyypit

Kaksi Affymetrix -pelimerkkiä. Ottelu on esitetty vasemmalla alhaalla koon vertailu.

On olemassa monia erilaisia ​​matriiseja, ja suurin ero on se, onko ne järjestetty avaruudellisesti pinnalle vai koodatuille helmille:

  • Perinteinen kiinteäfaasijärjestelmä on kokoelma järjestettyjä mikroskooppisia "pisteitä", joita kutsutaan ominaisuuksiksi, joissa kussakin on tuhansia identtisiä ja spesifisiä koettimia, jotka on kiinnitetty kiinteään pintaan, kuten lasi- , muovi- tai pii- siru (tunnetaan yleisesti nimellä genomisiru , DNA siru tai geeniryhmä ). Tuhannet näistä ominaisuuksista voidaan sijoittaa tunnettuihin paikkoihin yhdellä DNA -mikrosarjalla.
  • Vaihtoehtoinen helmiryhmä on kokoelma mikroskooppisia polystyreenihelmiä, joista jokaisella on erityinen koetin ja kahden tai useamman väriaineen suhde, jotka eivät häiritse kohdesekvenssissä käytettyjä fluoresoivia värejä.

DNA -mikropiirejä voidaan käyttää DNA: n havaitsemiseen (kuten vertailukelpoisessa genomisessa hybridisaatiossa ) tai RNA: n (yleisimmin cDNA: ksi käänteiskopioinnin jälkeen ) havaitsemiseen, joka voidaan tai ei välttämättä käännetä proteiineiksi. Prosessia geeniekspression mittaamiseksi cDNA: n kautta kutsutaan ekspressioanalyysiksi tai ekspressioprofiloimiseksi .

Sovelluksia ovat:

Sovellus tai tekniikka Tiivistelmä
Geenien ilmentymisen profilointi Kun mRNA: n tai geenin ilmentymisen profilointi kokeilu ilmentymisen tasot tuhansien geenien samanaikaisesti seurataan tutkia tiettyjen hoitojen, sairauksia , ja kehitysvaiheet geenien ilmentymisen. Esimerkiksi mikrotyyppipohjaista geeniekspressioprofilointia voidaan käyttää tunnistamaan geenit, joiden ilmentyminen muuttuu vasteena patogeeneille tai muille organismeille vertaamalla geenin ilmentymistä infektoituneessa ja tarttumattomissa soluissa tai kudoksissa.
Vertaileva genominen hybridisaatio Genomipitoisuuden arviointi eri soluissa tai lähisukuisissa organismeissa, kuten Patrick Brown , Jonathan Pollack, Ash Alizadeh ja Stanfordin kollegat alun perin kuvaavat .
GeneID Pieni mikrosiruja tarkistaa tunnukset organismien elintarvikkeissa ja rehuissa (kuten GMO [1] ), mykoplasmat soluviljelmässä, tai patogeenien tautien havaitsemista, enimmäkseen yhdistämällä PCR ja microarray-tekniikkaa.
Chromatin -immunosaostus sirulle Tiettyyn proteiiniin sitoutuneet DNA -sekvenssit voidaan eristää immunosaostamalla kyseinen proteiini ( ChIP ), nämä fragmentit voidaan sitten hybridisoida mikrotyynyksi (kuten laatoitussarjaksi ), mikä mahdollistaa proteiinin sitoutumiskohdan varautumisen määrittämisen koko genomissa. Esimerkki proteiinista immunosaostukseen ovat histonin modifikaatiot ( H3K27me3 , H3K4me2, H3K9me3 jne.), Polycomb-ryhmän proteiini (PRC2: Suz12, PRC1: YY1) ja trithorax-ryhmän proteiini (Ash1) epigeneettisen maiseman tutkimiseksi tai tutkittava RNA-polymeraasi II transkriptio maisemaa .
DamID Analogisesti ChIP , genomiset alueet sitoo kiinnostuksen kohteena olevaa proteiinia voidaan eristää ja sitä käytettiin koettimena microarray määrittää sitoutumiskohdan käyttöaste. Toisin kuin ChIP, DamID ei vaadi vasta -aineita, mutta käyttää adeniinimetylaatiota lähellä proteiinin sitoutumiskohtia monistamaan selektiivisesti näitä alueita.Se lisätään ilmaisemalla pieniä määriä kiinnostavaa proteiinia fuusioituna bakteeri -DNA -adeniinimetyylitransferaasiin .
SNP -tunnistus Yksittäisen nukleotidin polymorfismin tunnistaminen alleelien keskuudessa populaatioissa tai niiden välillä. Useat mikropiirien sovellukset käyttävät SNP-havaitsemista, mukaan lukien genotyypin määrittäminen , rikostekninen analyysi, taudille alttiuden mittaaminen , lääkekandidaattien tunnistaminen, ituradan mutaatioiden arviointi yksilöissä tai somaattiset mutaatiot syövissä, heterotsygoottisuuden menetyksen arviointi tai geneettinen sidosanalyysi .
Vaihtoehtoisen silmukoinnin havaitseminen Eksoniliitoskohdan array suunnittelu käytöt spesifisiä koettimia odotettu tai mahdollinen liitos kohtiin ennustettu eksonien geeniä. Se on keskitiheydeltään tai peittävyydeltään tyypilliselle geeniekspressiotaulukolle (1–3 koetinta geeniä kohden) ja genomiselle laatoitussarjalle (satoja tai tuhansia koettimia per geeni). Sitä käytetään geenin vaihtoehtoisten silmukointimuotojen ilmentymisen määrittämiseen. Exon -matriiseilla on erilainen rakenne, ja ne käyttävät koettimia, jotka on suunniteltu havaitsemaan jokainen yksittäinen eksoni tunnetuille tai ennustetuille geeneille, ja niitä voidaan käyttää eri silmukointi -isoformien havaitsemiseen.
Fuusiogeenien mikrosarja Fuusiogeenimikrosarja voi havaita fuusiotranskriptit, esimerkiksi syöpänäytteistä. Tämän periaate perustuu vaihtoehtoisiin silmukointimikrosarjoihin . Oligo-suunnittelustrategia mahdollistaa kimeeristen transkriptiliitosten yhdistämisen yhdessä yksittäisten fuusiokumppaneiden eksonisten mittausten kanssa.
Laatoitus Genomilaatoitusjärjestelmät koostuvat päällekkäisistä koettimista, jotka on suunniteltu edustamaan tiheästi kiinnostavaa genomista aluetta, joka on joskus yhtä suuri kuin koko ihmisen kromosomi. Tarkoituksena on empiirisesti havaita transkriptien tai vaihtoehtoisesti silmukoitujen muotojen ilmentyminen, joita ei ehkä ole aiemmin tunnettu tai ennustettu.
Kaksijuosteiset B-DNA-mikropiirit Oikeakätisiä kaksijuosteisia B-DNA-mikrosarjoja voidaan käyttää luonnehtimaan uusia lääkkeitä ja biologisia aineita, joita voidaan käyttää sitoutumaan immobilisoidun, ehjän, kaksijuosteisen DNA: n tiettyihin alueisiin. Tätä lähestymistapaa voidaan käyttää geeniekspression estämiseen. Ne mahdollistavat myös niiden rakenteen karakterisoinnin erilaisissa ympäristöolosuhteissa.
Kaksijuosteiset Z-DNA-mikropiirit Vasenkätisiä kaksijuosteisia Z-DNA-mikrotyynyjä voidaan käyttää tunnistamaan vaihtoehtoisen Z-DNA-rakenteen lyhyet sekvenssit, jotka sijaitsevat oikeakätisten B-DNA-geenien pidemmillä osilla (esim. Transkription tehostaminen, rekombinaatio, RNA-muokkaus). Mikrosarjat mahdollistavat myös niiden rakenteen karakterisoinnin erilaisissa ympäristöolosuhteissa.
Monisäikeiset DNA-mikrosarjat (kolminkertaiset DNA-mikrosarjat ja nelipaksiset DNA-mikrosarjat) Monisäikeisiä DNA- ja RNA-mikropiirejä voidaan käyttää uusien lääkkeiden tunnistamiseen, jotka sitoutuvat näihin monisäikeisiin nukleiinihapposekvensseihin. Tätä lähestymistapaa voidaan käyttää uusien lääkkeiden ja biologisten aineiden löytämiseen, jotka kykenevät estämään geenien ilmentymistä. Nämä mikrosarjat mahdollistavat myös niiden rakenteen karakterisoinnin erilaisissa ympäristöolosuhteissa.

Tietyille viljelykasveille räätälöidyt erikoisryhmät ovat yhä suositumpia molekyylijalostuksen sovelluksissa. Tulevaisuudessa niitä voitaisiin käyttää taimien seulomiseen varhaisessa vaiheessa, jotta voidaan vähentää tarpeettomien taimien määrää, joita on kokeiltu jalostustoiminnassa.

Valmistus

Mikrosäteitä voidaan valmistaa eri tavoin tutkittavien koettimien lukumäärän, kustannusten, räätälöintivaatimusten ja esitettävän tieteellisen kysymyksen mukaan. Kaupallisten toimittajien matriiseissa voi olla vain 10 anturia tai jopa 5 miljoonaa mikrometrin mittakaavaa.

Spotted vs. in situ syntetisoituja matriiseja

DNA-mikrosiru on tulostettu robotti on University of Delaware

Mikrosäteitä voidaan valmistaa käyttämällä erilaisia ​​tekniikoita, mukaan lukien tulostus hienokärkisillä nastoilla lasilevyille, fotolitografia valmiilla naamioilla, fotolitografia käyttäen dynaamisia mikrotyyppisiä laitteita, mustesuihkutulostus tai sähkökemia mikroelektrodijärjestelmille.

On täplikäs mikrosiruja , koettimet ovat oligonukleotideja , cDNA: ta tai pieni fragmentit PCR- tuotteita, jotka vastaavat mRNA: iden . Koettimet syntetisoidaan ennen kerrostumista matriisin pinnalle ja "täplätään" sitten lasille. Yleinen lähestymistapa käyttää joukkoa hienoja tappeja tai neuloja, joita ohjaa robotti käsivarsi. Tuloksena oleva koettimien "ruudukko" edustaa valmistettujen koettimien nukleiinihappoprofiileja ja on valmis vastaanottamaan komplementaarisia cDNA- tai cRNA -"kohteita", jotka on johdettu kokeellisista tai kliinisistä näytteistä. Tätä tekniikkaa käyttävät tutkijat ympäri maailmaa tuottamaan "sisäisiä" painettuja mikrolevyjä omasta laboratoriostaan. Näitä matriiseja voidaan helposti muokata kullekin kokeelle, koska tutkijat voivat valita koettimet ja tulostuspaikat matriiseille, syntetisoida koettimet omassa laboratoriossaan (tai yhteistyölaitoksessaan) ja havaita taulukot. He voivat sitten luoda omia leimattuja näytteitä hybridisaatiota varten, hybridisoida näytteet taulukkoon ja lopulta skannata taulukot omilla laitteillaan. Tämä tarjoaa suhteellisen edullisen mikrosarjan, joka voidaan räätälöidä kullekin tutkimukselle, ja välttää usein kalliimpien kaupallisten matriisien ostamiskustannukset, jotka voivat edustaa suurta määrää geenejä, jotka eivät kiinnosta tutkijaa. On olemassa julkaisuja, jotka osoittavat, että sisäiset pilkulliset mikropiirit eivät välttämättä tarjoa samaa herkkyystasoa kuin kaupalliset oligonukleotidiryhmät, mahdollisesti johtuen pienistä erikoista ja pienemmistä tulostustehokkuuksista verrattuna oligoryhmien teollisiin valmistajiin.

In oligonukleotidimikrosiruihin , koettimet ovat lyhyitä sekvenssejä suunniteltu vastaamaan osia sekvenssin tiedetty tai ennustettu avointa lukukehystä . Vaikka oligonukleotidikoettimia käytetään usein "täplikkäissä" mikropiireissä, termi "oligonukleotidiryhmä" viittaa useimmiten tiettyyn valmistustekniikkaan. Oligonukleotidiryhmiä tuotetaan tulostamalla lyhyitä oligonukleotidisekvenssejä, jotka on suunniteltu edustamaan yksittäistä geeniä tai geeniliitosvarianttien perhettä syntetisoimalla tämä sekvenssi suoraan taulukon pinnalle sen sijaan, että talletettaisiin ehjiä sekvenssejä. Sekvenssit voivat olla pidempiä (60-meeriset koettimet, kuten Agilent- malli) tai lyhyempiä ( Affymetrixin tuottamia 25-meerisiä koettimia ) halutusta tarkoituksesta riippuen; pidemmät koettimet ovat spesifisempiä yksittäisille kohdegeeneille, lyhyemmät koettimet voidaan havaita suuremmalla tiheydellä koko ryhmässä ja ne ovat halvempia valmistaa. Yksi tekniikka, jota käytetään oligonukleotidiryhmien tuottamiseen, sisältää fotolitografisen synteesin (Affymetrix) piidioksidisubstraatilla, jossa valoa ja valolle herkkiä peiteaineita käytetään "rakentamaan" sekvenssi yksi nukleotidi kerrallaan koko matriisin läpi. Jokainen soveltuva koetin "paljastetaan" valikoivasti ennen matriisin uimista yhden nukleotidin liuoksessa, sitten tapahtuu peitereaktio ja seuraava koettimien sarja paljastetaan valmistautuessaan erilaiseen nukleotidialtistukseen. Monien toistojen jälkeen jokaisen koettimen sekvenssit rakennetaan täysin. Äskettäin NimbleGen Systemsin Maskless Array Synthesis on yhdistänyt joustavuuden suureen määrään koettimia.

Kaksikanavainen vs. yhden kanavan tunnistus

Kaavio tyypillisestä kaksivärisestä mikrosarjakokeesta

Kaksiväriset mikrosarjat tai kaksikanavaiset mikrosarjat hybridisoidaan tyypillisesti kahdesta vertailtavasta näytteestä valmistetun cDNA: n kanssa (esim. Sairas kudos verrattuna terveeseen kudokseen) ja leimataan kahdella eri fluoroforilla . Fluoresoivia väriaineita, joita käytetään yleisesti cDNA -merkinnöissä, ovat Cy 3, jonka fluoresenssiemissioaallonpituus on 570 nm (vastaa valonspektrin vihreää osaa), ja Cy 5, jonka fluoresenssiemissioaallonpituus on 670 nm (vastaa valonspektri). Kaksi Cy-leimatun cDNA-näytteet sekoitetaan ja hybridisoitui yhteen microarray, joka on sitten skannattu microarray skannerin fluoresenssin visualisoimiseksi, että kahden fluoroforin jälkeen virityksen kanssa laser säde on määritelty aallonpituus. Kunkin fluoroforin suhteellisia intensiteettejä voidaan sitten käyttää suhdepohjaisessa analyysissä ylös- ja alasäädettyjen geenien tunnistamiseksi.

Oligonukleotidimikrosarjoissa on usein kontrollikoettimia, jotka on suunniteltu hybridisoitumaan RNA-piikkien kanssa . Piikkien ja kontrollikoettimien välisen hybridisaation astetta käytetään normalisoimaan kohdesondien hybridisaatiomittaukset. Vaikka geeniekspression absoluuttiset tasot voidaan harvinaisissa tapauksissa määrittää kaksiväriryhmässä, suhteelliset erot ekspressiossa näytteen eri pisteiden välillä ja näytteiden välillä ovat edullisin menetelmä kaksivärijärjestelmän tietojen analysoimiseksi . Esimerkkejä tällaisten mikropiirien tarjoajista ovat Agilent Dual-Mode -alustallaan, Eppendorf DualChip-alustalla kolorimetrisille Silverquant- merkinnöille ja TeleChem International Arrayitin kanssa .

In yksikanavaista microarray tai yksi-väri mikrosiruja , taulukoiden säätää intensiteetti tiedot kunkin koettimen tai koetin joukko osoittaa suhteellisen tason hybridisaation leimatun kohde. Ne eivät kuitenkaan todella osoita geenin runsaustasoa, vaan suhteellista runsautta verrattuna muihin näytteisiin tai olosuhteisiin, kun niitä käsitellään samassa kokeessa. Kukin RNA-molekyyli kohtaa protokollan ja eräkohtaisen harhan monistamis-, leimaus- ja hybridisaatiovaiheissa kokeilun aikana, jolloin vertailut saman mikrotason geenien välillä ovat epäinformatiivisia. Kahden geenin kahden tilan vertailu vaatii kaksi erillistä yksiväristä hybridisaatiota. Useita suosittuja yksikanavaisia ​​järjestelmiä ovat Affymetrix "Gene Chip", Illumina "Bead Chip", Agilent yksikanavaiset taulukot, Applied Microarrays "CodeLink" -järjestelmät ja Eppendorf "DualChip & Silverquant". Yksi yksivärijärjestelmän vahvuus on se, että poikkeava näyte ei voi vaikuttaa muista näytteistä saatuun raakatietoon, koska jokainen matriisisiru altistuu vain yhdelle näytteelle (toisin kuin kaksivärinen järjestelmä, jossa yksi heikko -laatunäyte voi vaikuttaa merkittävästi yleiseen tietojen tarkkuuteen, vaikka toinen näyte olisi korkealaatuinen). Toinen etu on, että tietoja on helpompi verrata eri kokeiden matriiseihin, kunhan erävaikutukset on otettu huomioon.

Yhden kanavan mikrosarja voi olla ainoa vaihtoehto joissakin tilanteissa. Oletetaan, että näytteitä on vertailtava: kahden kanavajärjestelmän avulla vaadittujen kokeiden määrä muuttuu nopeasti mahdottomaksi, ellei näytettä käytetä vertailukohtana.

näytteiden lukumäärä yksikanavainen mikrosarja kaksikanavainen mikrosarja

kaksikanavainen mikrosarja (viittauksella)

1 1 1 1
2 2 1 1
3 3 3 2
4 4 6 3

Tyypillinen protokolla

Esimerkkejä mikrotyynyjen käyttöasteista. Organismien sisällä geenit transkriboidaan ja silmukoidaan kypsien mRNA -transkriptien (punainen) tuottamiseksi. MRNA uutetaan organismista ja käänteistranskriptaasia käytetään kopioimaan mRNA stabiiliin ds-cDNA: han (sininen). Mikrolevyissä ds-cDNA on fragmentoitu ja leimattu fluoresoivasti (oranssi). Leimatut fragmentit sitoutuvat komplementaaristen oligonukleotidien järjestettyyn joukkoon, ja fluoresoivan intensiteetin mittaus koko taulukossa osoittaa ennalta määrätyn sekvenssiryhmän runsauden. Nämä sekvenssit valitaan tyypillisesti erityisesti raportoimaan kiinnostavista geeneistä organismin genomissa.

Tämä on esimerkki DNA -mikrokokoonpanokokeesta, joka sisältää yksityiskohdat tiettyä tapausta varten selventämään paremmin DNA -mikrokokoonpanokokeita ja luettelee muutokset RNA: ta tai muita vaihtoehtoisia kokeita varten.

  1. Kaksi vertailtavaa näytettä (pareittain vertailu) kasvatetaan/hankitaan. Tässä esimerkissä käsitelty näyte ( tapaus ) ja käsittelemätön näyte ( kontrolli ).
  2. Nukleiinihappo kiinnostavia puhdistetaan: tämä voi olla RNA: ta varten ilmentymisen profilointi , DNA ja vertaileva hybridisaatiota , tai DNA / RNA-sidottu tiettyyn proteiiniin , joka on immu- ( ChIP-on-chip ) ja epigeneettisten tai asetuksen tutkimuksia. Tässä esimerkissä kokonais-RNA eristetään (sekä ydin- että sytoplasminen ) Guanidiniumtiosyanaatti-fenoli-kloroformiuutolla (esim. Trizol ), joka eristää suurimman osan RNA: sta (kun taas pylväsmenetelmillä on 200 nukleotidin raja) ja jos se tehdään oikein, se on puhtaampi.
  3. Puhdistetun RNA: n laatu ( kapillaarielektroforeesilla ) ja määrä analysoidaan (esimerkiksi käyttämällä NanoDrop- tai NanoPhotometer -spektrometriä ). Jos materiaali on hyväksyttävää laatua ja sitä on riittävästi (esim.> 1 μg , vaikka vaadittu määrä vaihtelee microarray -alustan mukaan), koe voidaan jatkaa.
  4. Leimattu tuote muodostetaan käänteistranskriptiolla ja sitä seuraa valinnainen PCR -monistus. RNA käänteiskopioidaan joko polyT -alukkeilla (jotka monistavat vain mRNA: ta ) tai satunnaisalukkeilla (jotka monistavat kaiken RNA: n, joista suurin osa on rRNA: ta ). miRNA -mikrosarjat ligatoivat oligonukleotidin puhdistettuun pieneen RNA: han (eristetty fraktioijalla), joka sitten käänteiskopioidaan ja monistetaan.
    • Leima lisätään joko käänteiskopiointivaiheen aikana tai monistamisen jälkeen, jos se suoritetaan. Mielessä merkinnät on riippuvainen mikrosirulla; esim. jos etiketti lisätään RT -seoksen kanssa, cDNA on antisense ja mikrokaavioanturi on järkevä, paitsi negatiivisten kontrollien tapauksessa.
    • Leima on tyypillisesti fluoresoiva ; vain yksi kone käyttää radiomerkintöjä .
    • Merkintä voi olla suora (ei käytössä) tai epäsuora (vaatii kytkentävaiheen). Kaksikanavaisessa matriisia, kytkennän vaihe tapahtuu ennen hybridisaatiota käyttäen aminoallyyli uridiini trifosfaatin (aminoallyyli-UTP: tä, tai aaUTP) ja NHS amino-reaktiivisten väriaineiden (kuten syaniinivärit ); yksikanavaisille ryhmille kytkentävaihe tapahtuu hybridisaation jälkeen käyttäen biotiinia ja leimattua streptavidiinia . Modifioidut nukleotidit (yleensä suhteessa 1 aaUTP: 4 TTP ( tymidiinitrifosfaatti )) lisätään entsymaattisesti pienessä suhteessa normaaleihin nukleotideihin, jolloin tyypillisesti saadaan 1 joka 60 emästä. AaDNA puhdistetaan sitten pylväällä (käyttäen fosfaattipuskuriliuosta, koska Tris sisältää amiiniryhmiä). Aminoalyyliryhmä on amiiniryhmä nukleoemäkseen kiinnitetyllä pitkällä linkkerillä, joka reagoi reaktiivisen väriaineen kanssa.
      • Muoto rinnakkaisten tunnetaan väriaineen läppä voidaan suorittaa ohjaus väriaineen esineitä kahden kanavan kokeet; värin kääntöä varten käytetään toista diaa, jolloin tarrat vaihdetaan (näyte, joka oli merkitty Cy3: lla ensimmäisessä diassa, on merkitty Cy5: llä ja päinvastoin). Tässä esimerkissä aminoalyyli -UTP on läsnä käänteiskopioidussa seoksessa.
  5. Leimatut näytteet sekoitetaan sitten patentoidun hybridisaatioliuoksen kanssa , joka voi koostua SDS: stä , SSC: stä , dekstraanisulfaatista , estoaineesta (kuten Cot-1-DNA , lohen siittiöiden DNA, vasikan kateenkorvan DNA, PolyA tai PolyT), Denhardtin liuoksesta , tai formamiinia .
  6. Seos denaturoidaan ja lisätään mikrotyynyn reikiin. Reiät suljetaan ja mikrotyyny hybridisoidaan joko hyb -uunissa, jossa mikrotyyny sekoitetaan kiertämällä, tai sekoittimessa, jossa mikrotyyny sekoitetaan vaihtelevalla paineella neulareikiin.
  7. Yön yli tapahtuvan hybridisaation jälkeen kaikki epäspesifinen sitoutuminen pestään pois (SDS ja SSC).
  8. Mikrosarja kuivataan ja skannataan koneella, joka käyttää väriainetta laserilla ja mittaa päästöt ilmaisimella.
  9. Kuva ruudutetaan mallilla ja kunkin ominaisuuden (koostuu useista pikseleistä) intensiteetit määritetään.
  10. Raakatiedot normalisoidaan; Yksinkertaisin normalisointimenetelmä on vähentää taustan intensiteetti ja asteikko siten, että kahden kanavan ominaisuuksien kokonaisintensiteetit ovat yhtä suuret, tai käyttää referenssigeenin intensiteettiä kaikkien intensiteettien t-arvon laskemiseen . Kehittyneempiä menetelmiä ovat z-suhde , löysä ja matala regressio ja RMA (vankka monisiru-analyysi) Affymetrix-siruille (yksikanavainen, piisiru, in situ syntetisoidut lyhyet oligonukleotidit).

Mikropiirit ja bioinformatiikka

Mikroarray -kokeiden geenien ilmentymisarvot voidaan esittää lämpökarttoina, jotka visualisoivat data -analyysin tuloksen.

Edullisten microarray -kokeiden syntyminen loi useita erityisiä bioinformatiikan haasteita: moninkertaiset replikaatiotasot kokeellisessa suunnittelussa ( Experimental design ); alustojen ja riippumattomien ryhmien lukumäärä ja tietomuoto ( standardointi ); tietojen tilastollinen käsittely ( data -analyysi ); jokaisen koettimen kartoittaminen sen mittaamaan mRNA -transkriptiin ( huomautus ); pelkkä datamäärä ja mahdollisuus jakaa se ( tietojen varastointi ).

Kokeellinen suunnittelu

Koska biologinen monimutkaisuus geenin ilmentymisen, näkökohdat kokeellisen suunnittelun, joita käsitellään ilmentymisen profilointi artikkeli ovat ratkaisevan tärkeitä, jos tilastollisesti ja biologisesti voimassa päätelmät voidaan tehdä datasta.

Mikrotason kokeen suunnittelussa on otettava huomioon kolme pääelementtiä. Ensinnäkin biologisten näytteiden toistaminen on välttämätöntä kokeen johtopäätösten tekemiseksi. Toiseksi tekniset toisinnot (kaksi RNA -näytettä kustakin koeyksiköstä) auttavat varmistamaan tarkkuuden ja mahdollistamaan erojen tarkastelun hoitoryhmien sisällä. Biologiset toisinnot sisältävät riippumattomia RNA -uuttoja ja tekniset toisinnot voivat olla kaksi alikvoottia samasta uutosta. Kolmanneksi, kunkin cDNA -kloonin tai oligonukleotidin täplät ovat läsnä replikaattina (ainakin kaksoiskappaleina) mikrosarjan objektilasilla teknisen tarkkuuden mittaamiseksi kussakin hybridisaatiossa. Näytteen valmistelusta ja käsittelystä on keskusteltava kriittisesti, jotta voidaan tunnistaa kokeen riippumattomat yksiköt ja välttää liian suuret tilastollisesti merkittävät arviot .

Standardointi

Microarray -tietoja on vaikea vaihtaa, koska alustan valmistus, määritysprotokollat ​​ja analyysimenetelmät eivät ole standardoituja. Tämä tarjoaa yhteentoimivuuden ongelma bioinformatiikan . Erilaiset ruohonjuuritason avoimen lähdekoodin hankkeet yrittävät helpottaa muiden kuin sirujen avulla tuotetun datan vaihtoa ja analysointia:

Esimerkiksi "Vähimmäistietoja mikroarray -kokeesta " ( MIAME ) -luettelo auttaa määrittämään yksityiskohtaisuuden, jonka pitäisi olla olemassa, ja monet lehdet hyväksyvät sen edellytyksenä paperiarkkien lähettämiselle, jotka sisältävät microarray -tuloksia. Mutta MIAME ei kuvaa tietojen muotoa, joten vaikka monet muodot voivat tukea MIAME -vaatimuksia, vuodesta 2007 lähtien mikään muoto ei salli täydellisen semanttisen vaatimustenmukaisuuden tarkistamista. Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) toteuttaa "MicroArray Quality Control (MAQC) Project" -projektia kehittääkseen standardeja ja laadunvalvontamittareita, jotka mahdollistavat lopulta MicroArray-datan käytön lääkkeiden löytämisessä, kliinisessä käytännössä ja sääntelypäätöksissä . MGED Society on kehittänyt standardit edustus geenin ilmentymisen kokeen tulokset ja asiaan merkintöjä.

Tietojen analysointi

Kansallinen toksikologisen tutkimuskeskuksen tutkija tarkastelee mikrotason tietoja

Microarray -tietojoukot ovat yleensä erittäin suuria, ja analyyttiseen tarkkuuteen vaikuttavat monet muuttujat. Tilastollisiin haasteisiin kuuluu taustamelun vaikutusten huomioon ottaminen ja tietojen asianmukainen normalisointi . Normalisointimenetelmät voivat sopia tietyille alustoille, ja kaupallisten alustojen tapauksessa analyysi voi olla oma. Algoritmeihin, jotka vaikuttavat tilastolliseen analyysiin, kuuluvat:

  • Kuva-analyysi: ristikko, skannatun kuvan pisteentunnistus (segmentointialgoritmi), huonolaatuisten ja heikkolaatuisten ominaisuuksien poistaminen tai merkitseminen (nimeltään liputus ).
  • Tietojen käsittely: taustan vähennys (perustuu globaaliin tai paikalliseen taustaan), pistevoimakkuuksien ja intensiteettisuhteiden määrittäminen, tietojen visualisointi (esim. Katso MA-käyrä ) ja lukujen muunnos , intensiteettisuhteiden maailmanlaajuinen tai paikallinen normalisointi ja segmentointi eri kopioluku alueilla käyttäen vaiheen tunnistus algoritmeja.
  • Luokkahavaintoanalyysi: Tämä analyyttinen lähestymistapa, jota joskus kutsutaan valvomattomaksi luokitteluksi tai tiedon löytämiseksi, yrittää tunnistaa, koostuuko mikropiirejä (esineitä, potilaita, hiiriä jne.) Tai geenejä ryhmiin. Luonnollisesti olemassa olevien objektiryhmien (mikropiirit tai geenit) tunnistaminen, jotka yhdistyvät yhteen, voi mahdollistaa uusien ryhmien löytämisen, joita muuten ei aiemmin tiedetty. Tiedonhakuanalyysin aikana voidaan käyttää erilaisia ​​valvomattomia luokittelutekniikoita DNA -mikrotason tietojen kanssa uusien matriisiryhmien (luokkien) tunnistamiseksi. Tämäntyyppinen lähestymistapa ei ole hypoteesipohjainen, vaan perustuu pikemminkin iteratiiviseen kuvion tunnistamiseen tai tilastollisiin oppimismenetelmiin "optimaalisen" klustereiden määrän löytämiseksi tiedoista. Esimerkkejä valvomattomista analyysimenetelmistä ovat itseorganisoituvat kartat, hermokaasu, k-keskiarvoryhmien analyysit, hierarkinen klusterianalyysi, genomiseen signaalinkäsittelyyn perustuva klusterointi ja mallipohjainen klusterianalyysi. Joidenkin näiden menetelmien osalta käyttäjän on myös määriteltävä etäisyys objektiparien välillä. Vaikka yleensä käytetään Pearsonin korrelaatiokerrointa, kirjallisuudessa on ehdotettu ja arvioitu useita muita mittareita. Luokan etsintäanalyyseissä käytetyt syöttötiedot perustuvat yleensä luetteloihin geeneistä, joilla on korkea informaatiokyky (alhainen melu) ja jotka perustuvat alhaisiin variaatiokerroimen arvoihin tai korkeisiin Shannonin entropian arvoihin jne. Todennäköisimmän tai parhaan mahdollisen klustereita, jotka on saatu valvomattomasta analyysistä, kutsutaan klusterin validiteetiksi. Joitakin yleisesti käytettyjä mittareita klusterin pätevyydelle ovat siluetti-indeksi, Davies-Bouldin-indeksi, Dunnin indeksi tai Hubertin tilastot.
  • Luokan ennusteanalyysi: Tämä lähestymistapa, jota kutsutaan valvotuksi luokitteluksi, luo perustan ennustavan mallin kehittämiselle, johon tulevat tuntemattomat testiobjektit voidaan syöttää, jotta voidaan ennustaa testiobjektien todennäköisin luokkajäsenyys. Valvottu analyysi luokan ennustamiseen sisältää tekniikoiden, kuten lineaarisen regression, k-lähimmän naapurin, oppimisvektorikvantisoinnin, päätöspuun analyysin, satunnaisten metsien, naiivien Bayesin, logistisen regression, ytimen regression, keinotekoisten hermoverkkojen, tukivektorikoneiden, asiantuntijaseosten käytön ja valvottua hermokaasua. Lisäksi käytetään erilaisia ​​metaheuristisia menetelmiä, kuten geneettisiä algoritmeja , kovarianssimatriisin itsesopeutumista, hiukkasparvien optimointia ja muurahaispesäkkeiden optimointia . Syötetiedot luokan ennustamiseen perustuvat yleensä suodatettuihin luetteloihin geeneistä, jotka ennustavat luokkaa, jotka määritetään käyttämällä klassisia hypoteesitestejä (seuraava osa), Gini -monimuotoisuusindeksiä tai tiedon saantia (entropia).
  • Hypoteesipohjainen tilastollinen analyysi: Tilastollisesti merkitsevien muutosten tunnistaminen geeniekspressiossa tunnistetaan yleisesti käyttämällä t-testiä , ANOVA: ta , Bayesin menetelmää Mann-Whitney-testimenetelmiä, jotka on räätälöity mikrotason tietojoukkoihin ja joissa on otettu huomioon useita vertailuja tai klusterianalyyseja . Nämä menetelmät arvioivat tilastollista tehoa tietojen vaihtelun ja kokeellisten toistojen määrän perusteella ja voivat auttaa minimoimaan tyypin I ja tyypin II virheet analyyseissä.
  • Ulottuvuuden pienentäminen: Analyytikot vähentävät usein ulottuvuuksien (geenien) määrää ennen tietojen analysointia. Tämä voi sisältää lineaarisia lähestymistapoja, kuten pääkomponenttien analysointia (PCA) tai epälineaarista moninaista oppimista (etäisyysmetriikkaopetus), jossa käytetään ytimen PCA: ta, diffuusiokarttoja, Laplacian ominaiskarttoja, paikallista lineaarista upottamista, paikallisesti säilyttäviä ennusteita ja Sammonin kartoittamista.
  • Verkostoon perustuvat menetelmät: Tilastolliset menetelmät, joissa otetaan huomioon geeniverkkojen taustalla oleva rakenne ja jotka edustavat joko assosiatiivisia tai syy-seuraavia vuorovaikutuksia tai riippuvuuksia geenituotteiden välillä. Painotettua geenin ilmentämisverkkoanalyysiä käytetään laajalti rinnakkaisekspressiomoduulien ja intramodulaaristen napageenien tunnistamiseen. Moduulit voivat vastata solutyyppejä tai reittejä. Hyvin kytketyt intramodulaariset keskittimet edustavat parhaiten niiden moduuleja.

Microarray -tiedot voivat vaatia jatkokäsittelyä, jonka tarkoituksena on vähentää tietojen ulottuvuutta ymmärtämisen ja tarkemman analyysin helpottamiseksi. Muut menetelmät mahdollistavat tietojen analysoinnin, joka koostuu pienestä määrästä biologisia tai teknisiä toisintoja ; esimerkiksi paikallisen yhdistetyn virheen (LPE) testi yhdistää vakiopoikkeamia geeneistä, joilla on samanlaiset ilmentymistasot, pyrkien kompensoimaan riittämätöntä replikaatiota.

Huomautus

Suhde koettimen ja mRNA: n välillä, jonka sen odotetaan havaitsevan, ei ole triviaali. Jotkut mRNA: t voivat ristiin hybridisoitua koettimia ryhmässä, joiden oletetaan havaitsevan toisen mRNA: n. Lisäksi mRNA: t voivat kokea monistusvirhettä, joka on sekvenssi- tai molekyylispesifinen. Kolmanneksi, koettimet, jotka on suunniteltu havaitsemaan tietyn geenin mRNA, voivat luottaa genomiseen EST -tietoon, joka on liitetty väärin kyseiseen geeniin.

Tietojen varastointi

Microarray -tietojen havaittiin olevan hyödyllisempiä verrattuna muihin vastaaviin tietojoukkoihin. Pelkkä datamäärä, erikoismuodot (kuten MIAME ) ja tietojoukkoihin liittyvät kuratointipyrkimykset edellyttävät erikoistuneita tietokantoja tietojen tallentamiseen. Useita avoimen lähdekoodin tietovarastoratkaisuja, kuten InterMine ja BioMart , on luotu erityistä tarkoitusta varten integroida erilaisia ​​biologisia tietojoukkoja ja tukea myös analysointia.

Vaihtoehtoiset tekniikat

Massiivisen rinnakkaisen sekvensoinnin edistysaskeleet ovat johtaneet RNA-Seq- tekniikan kehittämiseen, joka mahdollistaa koko transkriptiaalisen haulikon lähestymistavan geeniekspression karakterisoimiseksi ja kvantifioimiseksi. Toisin kuin mikrosarjat, jotka tarvitsevat vertail genomin ja transkriptomin, ennen kuin mikrokaavio voidaan suunnitella, RNA-Seq voidaan käyttää myös uusille malliorganismeille, joiden genomia ei ole vielä sekvensoitu.

Sanasto

  • Array tai dia on kokoelma ominaisuuksia tilallisesti järjestetty kaksiulotteinen ruudukko, järjestettyinä riveihin ja rivit.
  • Lohko tai alaryhmä : täplien ryhmä, joka tehdään tyypillisesti yhdellä tulostuskierroksella; useat alaryhmät/ lohkot muodostavat taulukon.
  • Tapaus/kontrolli : kokeellinen suunnittelumalli, joka sopii erityisesti kaksivärijärjestelmään, jossa kontrollina valittua tilaa (kuten terve kudos tai tila) verrataan muuttuneeseen tilaan (kuten sairas kudos tai tila).
  • Kanava : fluoresenssilähtö, joka on tallennettu skanneriin yksittäiselle fluoroforille ja voi olla jopa ultravioletti.
  • Väriaine läppä tai värjätä Vaihdetaan tai fluori käänteinen : vastavuoroinen merkinnät DNA-kohteiden kanssa, kaksi väriaineet huomioon väriaineen bias kokeissa.
  • Skanneri : laite, jota käytetään havaitsemaan ja kvantifioimaan pisteiden fluoresenssin voimakkuus mikrosarjan objektilasilla, jännittämällä valikoivasti fluoroforeja laserilla ja mittaamalla fluoresenssi suodatin (optiikka) -valomonistinjärjestelmällä .
  • Piste tai ominaisuus : pieni alue taulukon diassa, joka sisältää pikomooleja tietyistä DNA -näytteistä.
  • Katso muut asiaankuuluvat termit:

Katso myös

Viitteet

Ulkoiset linkit