Avaimenreikä limpet hemocyanin - Keyhole limpet hemocyanin
Keyhole hemosyaniini (KLH) on suuri, moniyksikköisten, kuljettaa happea, metalliproteiini joka löytyy hemolymfassa on jättiläinen keyhole limpet , Megathura crenulata , lajin keyhole limpet kautta elämää rannikolla Kaliforniassa , mistä Monterey Bay kohteeseen Isla Asuncion pois Baja California .
Proteiinin ominaisuudet
On olemassa kaksi avaimenreiän limpet -hemosyaniinigeeniä , joita kutsutaan KLH1: ksi ja KLH2: ksi ja joilla on noin 60% identtisyys proteiinitasolla. Molemmat koodaavat suuria glykosyloituja proteiineja, jotka koostuvat noin 3400 aminohaposta ja molekyylipainosta noin 390 000 daltonia , pois lukien glykosylaatio. Proteiini oligomeroituu muodostaen tynnyrin muotoisen didecameric -kompleksin, joka koostuu 20 monomeeristä. KLH -alayksikön jokainen domeeni sisältää kaksi kupariatomia , jotka yhdessä sitovat yhden happimolekyylin (O 2 ). Kun happi sitoutuu hemosyaniiniin, molekyyli saa erottuvan läpinäkyvän , opalisoivan sinisen värin, johtuen kuparin Cu 2+ -tilasta. Hapen puuttuessa sitoutunut kupari on Cu 1+ ja hemosyaniini on väritöntä. KLH -proteiini on voimakkaasti immunogeeninen, mutta ei aiheuta haitallista immuunivastetta ihmisillä. Siksi sitä arvostetaan rokotteen kantajaproteiinina. Kokonsa ja glykosylaationsa vuoksi KLH -proteiinia ei voida tuottaa synteettisesti; sitä on saatavana vain puhdistettuna biologisena tuotteena Megathura crenulata -aukon avaimenreiästä .
Puhdistus
KLH puhdistetaan Megathura crenulata -hemolymfistä useilla vaiheilla, jotka sisältävät tyypillisesti ammoniumsulfaattisaostuksen ja dialyysin, ja siihen voi sisältyä kromatografinen puhdistus parhaan puhtauden saavuttamiseksi. KLH -puhdistus voi sisältää myös endotoksiinin poiston, mutta tämä vaihe on usein tarpeeton, koska endotoksiini toimii adjuvanttina injektoitaessa vasta -aineiden tuotantoa varten.
Jos proteiini denaturoituu tai kupari -ionit menetetään puhdistusprosessissa, opaalinhohtoava sininen väri häviää ja liuoksesta tulee himmeä harmahtava väri. KLH: n denaturointi johtaa myös proteiinin taipumukseen aggregoitua ja saostua liuoksesta.
Käyttö biotekniikassa
Keyhole limpet hemosyaniinia (KLH) käytetään laajalti kantajaproteiinina vasta -aineiden tuotannossa tutkimukseen, biotekniikkaan ja terapeuttisiin sovelluksiin. Hapteenit ovat aineita, joilla on pieni molekyylipaino , kuten peptidejä , pieniä proteiineja ja lääkemolekyylejä, jotka eivät yleensä ole immunogeenisiä ja vaativat kantajaproteiinin apua immuunijärjestelmän vasteen stimuloimiseksi vasta -aineiden tuotannon muodossa. KLH on yleisimmin käytetty kantajaproteiini tähän tarkoitukseen. KLH on tehokas kantajaproteiini useista syistä. Sen suuri koko ja lukuisat epitoopit synnyttävät merkittävän immuunivasteen, ja runsaasti lysiinitähteitä hapteenien kytkemiseksi mahdollistaa korkean hapteeni: kantajaproteiinisuhteen, mikä lisää todennäköisyyttä tuottaa hapteenispesifisiä vasta-aineita. Lisäksi koska KLH on peräisin lonkasta, kotiloista, se on fylogeneettisesti kaukana nisäkkäiden proteiineista, mikä vähentää vääriä positiivisia tuloksia nisäkkäiden malliorganismien immunologisesti perustuvissa tutkimustekniikoissa.
KLH voi myös olla haastava molekyyli työskennellä, koska sillä on taipumus aggregoitua ja saostua. Aggregaatit pysyvät immunogeenisina, mutta rajoittavat kykyä konjugoida hapteenit, ja niitä on vaikea käsitellä laboratoriossa. Laadukas KLH-valmiste, jossa on kirkas opalisoiva sininen väri, on paras osoitus KLH-liukoisuudesta.
Tapahtui kytkentä
Hapteenit voidaan kytkeä KLH: hon useilla menetelmillä. Yksinkertainen yksivaiheinen kytkentä voidaan suorittaa käyttämällä karbodi-imidi- silloitusainetta EDC karboksyylien kovalenttiseksi kiinnittämiseksi primäärisiin amiineihin. Tämä menetelmä on helpoin suorittaa ja "satunnainen" suunta mahdollistaa vasta -aineiden muodostumisen kaikkia mahdollisia epitooppeja vastaan, mutta se johtaa yleensä jonkinasteiseen polymeroitumiseen, mikä vähentää liukoisuutta, mikä vaikeuttaa konjugaatin käsittelyä.
KLH voidaan aktivoida silloittimella Sulfo-SMCC , joka muuttaa lysiinitähteet sulfhydryylireaktiivisiksi maleimidiryhmiksi . Sulfhydryyliä sisältävä hapteeni voidaan sitten saattaa reagoimaan KLH: n kanssa immunogeenin täydentämiseksi aiheuttamatta polymeroitumista. Tämän reaktion spesifisyys on ihanteellinen tilanteissa, joissa kysteiini sijaitsee kaukana halutusta epitoopista (esim. Peptideissä, joissa terminaalinen kysteiini voidaan lisätä peptidin kumpaankin päähän). Maleimidi -aktivoitu KLH, jossa tämän kaksivaiheisen menettelyn ensimmäinen osa on valmis, on kaupallisesti saatavilla.
Muut kantajaproteiinit
- Concholepas concholepas hemocyanin (markkinoidaan Blue Carrierina)
- Naudan seerumin albumiini (BSA)
- Kationisoitu BSA (cBSA)
- Ovalbumiini
Käyttö syövän hoidossa
KLH: ta testataan useilla syöpärokotteilla , mukaan lukien non-Hodgkinin lymfooma , ihon melanooma , rinta- ja virtsarakon syöpä. Nämä rokotteet sisältävät spesifisiä kasvaimeen liittyviä antigeenejä, jotka on konjugoitu KLH: han tuumorin vastaisten immuunivasteiden stimuloimiseksi, jotka voivat tuhota kasvainsoluja.
Nopeasti kasvava kiinnostus syövän terapeuttisiin rokotteisiin (eli aktiivisiin immunoterapioihin) ja KLH: n dokumentoitu tehokkuus syöpärokotteiden ylivoimaisena kantajaproteiinina luovat merkittävät biolääkemarkkinat KLH -formulaatioille.
Analyysejä humoraalisen immuunivasteen seuraamiseksi KLH: ta vastaan ihmisen seerumissa on kehitetty helpottamaan biolääketieteellisten KLH -sovellusten optimaalista käyttöä.
Ekologiset näkökohdat
Johtuen hyödyllistä käyttöä KLH, The Giant keyhole limpet , josta KLH on peräisin, on ollut aiheena kasvavaa huolta kalastusbiologit osavaltiossa Kalifornian johtuu mahdollisuudesta overharvest lajien kaupallisiin tarkoituksiin. Giant Keyhole Limpets ei ole aluksi runsas laji, ja jotkut sukeltajat ovat raportoineet populaatioidensa vähenemisestä. Santa Barbaran Kalifornian yliopiston merentutkimusinstituutin vuonna 2006 julkaisemassa raportissa tiedemiehet ilmoittavat olevansa "erittäin huolissaan Giant Keyhole Limpetsin kalastuksesta" ja ehdottavat mahdollisuutta "tuhota niiden populaatiot". Turvallisen pitkän aikavälin KLH-lähteen varmistamiseksi monille liittovaltion sponsoroimille biolääketieteellisille tutkimusohjelmille, jotka käyttävät KLH: ta, liittovaltion virastot, mukaan lukien kansalliset terveyslaitokset ja National Science Foundation, ovat myös sponsoroineet tutkimusta Giant Keyhole Limpetin kestävän mariculture- tuotannon luomiseksi.