N-asyylifosfatidyylietanoliamiinispesifinen fosfolipaasi D- N-acyl phosphatidylethanolamine-specific phospholipase D

N-asyylifosfatidyylietanoliamiinifosfolipaasi D
Tunnisteet
Symboli NAPEPLD
NCBI -geeni 222236
HGNC 21683
OMIM 612334
ATE 4QN9
RefSeq NM_001122838
UniProt Q6IQ20
Muut tiedot
EY -numero 3.1.4.54
Locus Chr. 7 q22.1

N-asyyli fosfatidyylietanoliamiinia fosfolipaasi D ( niska-PLD ) on entsyymi, joka katalysoi N-acylethanolamine (NAE) peräisin N-asyyli-fosfatidyylietanoliamiini (niskassa). Tämä on tärkeä osa prosessia, joka muuntaa tavalliset lipidit kemiallisiksi signaaleiksi, kuten anandamidiksi ja oleoyylietanoliamiiniksi . Ihmisillä NAPE-PLD-proteiinia koodaa NAPEPLD- geeni .

Löytö

Niska-PLD on entsyymi toiminta - fosfolipaasi , joka vaikuttaa fosfolipideistä löytyy solukalvon . Se ei ole homologia, vaan sen toiminnan kemiallinen tulos luokittelee sen fosfolipaasi D: ksi . Entsymaattinen aktiivisuus löydettiin ja karakterisoitiin sarjassa kokeita, jotka päättyivät vuonna 2004 julkaistuun biokemialliseen puhdistusohjelmaan, josta peptidisekvensointi voitaisiin suorittaa. Tutkijoiden homogenoitiin (hienoksi jauhettu) sydämet 150 rotilla ja altistetaan saatu raaka lysaatti ja sakkaroosin sedimentaatio on 105000 x g erottaa solukalvoja jäljellä solun. Kiinteä kalvo proteiinit sitten liuottaa käyttäen oktyyliglukosidia ja altistettiin neljälle pylväskromatografialla vaiheet (HiTrap SP HP kationinvaihtokolonniin, HiTrap Q anioninvaihtokolonniin, HiTrap Blue affiniteettipylväässä, Bio-Gel HTP hydroksiapatiittikolonnissa). Kukin näistä erottaa erityyppiset kalvoproteiinit eri näyteastioihin, kun proteiinit eluoituvat pylväästä ajan mittaan, ja mittaamalla näytteiden aktiivisuus kussakin säiliössä oli mahdollista seurata, mitkä saivat aktiivisen entsyymin. Entsyymiaktiivisuuden mittaus tehtiin ohutkerroskromatografialla radioaktiiviselle substraatille, joka on herkkä NAPE-PLD-entsymaattiselle aktiivisuudelle: Substraatin lohkaisu vaikutti kohtaan, jossa se esiintyi levylle, kun säteily havaittiin biokuva-analysaattorilla.

Tämän laajan menettelyn tulos ei vieläkään ollut puhdas proteiini, mutta se tuotti rajoitetun määrän juovia SDS-PAGE: n avulla , ja yhden 46 kilodaltonin vyöhykkeen havaittiin korreloivan intensiteetin kanssa entsymaattisen aktiivisuuden kanssa. Tämä nauha leikattiin pois geelistä ja hajotettiin trypsiinillä , ja peptidit siitä erotettiin toisistaan käänteisfaasin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla . Tuloksena olevat fragmentit mikrosekvensoitiin sitten automaattisella Edman -hajoamisella . Kolme vastasi vimentiiniä , 56 kDa: n välituotefilamenttiproteiinia , jonka uskotaan olevan epäpuhtautta, ja kaksi muuta vastasi cDNA-kloonia, joka myöhemmin tunnistettiin NAPE-PLD: ksi.

Kun tämä vihje oli saatu, tunnistaminen voitaisiin vahvistaa vähemmän rasittavalla menetelmällä: Oletetun NAPE-PLD-cDNA: n yliekspressio COS-7-soluissa tuotti vahvan NAPE-PLD-entsymaattisen aktiivisuuden, jonka ominaisuudet osoitettiin olevan samanlaisia ​​kuin alkuperäinen sydänuute.

Ominaisuudet

NAPEPLD cDNA -sekvenssi ennustaa 396 aminohapon sekvenssejä, sekä hiirillä että rotilla, jotka ovat 89% ja 90% identtinen ihmisen. Niska-PLD havaittiin olevan mitään homologiaa tunnettujen fosfolipaasi D -geenit, mutta voidaan luokitella homologian pudota sinkki metallohydrolase perheen beeta-laktamaasin kertaiseksi . Erityisesti havaittiin erittäin säilynyt motiivi H X ( E / H ) X D ( C / R / S / H ) X 50-70 H X 15-30 ( C / S / D ) X 30-70 H , mikä liittyy yleensä sinkin sitoutumiseen ja hydrolyysireaktioon tässä proteiiniluokassa, mikä saa kirjoittajat ehdottamaan, että aktiivisuus korreloidaan sinkkipitoisuuden kanssa.

Kun rekombinantti niska-PLD testattiin COS-soluissa in vitro, sillä oli samankaltainen aktiivisuutta useita radioleimattua substraatit: N-palmitoylphosphatidylethanolamine, N-arachidonoylphosphatidylethanolamine, N-oleoylphosphatidylethanolamine, ja N-stearoylphosphatidylethanolamine kaikki reagoimaan K m välillä 2-4 mikromolaarinen ja V max välillä 73 ja 101 nanomoolia kohti milligrammaa kohti minuutissa, laskettu Lineweaver-Burk juoni . (Nämä tuottavat N- palmitoylethanolamine , anandamidi , N- oleoylethanolamine , ja N-stearoylethanolamine, vastaavasti) entsyymi reagoi myös N-palmitoyyli-lyso-fosfatidyylietanoliamiinia ja N-arakidonoyyli-lyso-fosfatidyylietanoliamiini, joilla on samankaltaisia K m , mutta yksi kolmasosalla -neljänneksi V max . Nämä toimet ovat johdonmukaisia ​​sen havainnon kanssa, että monet kudokset tuottavat erilaisia N -asyylietanoliamiinia .

Kuitenkin, niska-PLD ei ollut kyky tuottaa havaittavissa fosfatidihapon päässä fosfatidyylikoliinia tai fosfatidyylietanoliamiinia kuten katalysoi muiden fosfolipaasi D entsyymejä. Siitä puuttuu myös fosfolipaasi D: n transfosfatidylointiaktiivisuus, joka mahdollistaa fosfatidyylialkoholien muodostumisen fosfatidihapon sijasta etanolin tai butanolin läsnä ollessa .

Pathway

Tämä entsyymi toimii toisena vaiheena biokemiallisessa reitissä, joka käynnistettiin luomalla N -asyylifosfatidyylietanoliamiini , siirtämällä asyyliryhmä glyserofosfolipidin sn -1 -asemasta fosfatidyylietanoliamiinin aminoryhmään . Kun taas niska-PLD vaikuttaa osaltaan biosynteesiä useita NAES nisäkkään keskushermostossa , ei ole selvää, onko tämä entsyymi ei ole vastuussa muodostumista endokannabinoidijärjestelmä anandamidia , koska niskaa-PLD poistogeenisten hiirten on raportoitu olevan villityypin anandamidipitoisuudet tai hyvin pienet pitoisuudet.

N-acylethanolamines vapauttaa tämän entsyymin tulla potentiaalisia substraatteja varten rasvahapon kosamiiniamidihydrolaasi (FAAH), joka hydrolysoi vapaiden rasvahappojen päässä etanoliamiinia . Tämän entsyymin viat voivat aiheuttaa NAPE-PLD-tuotteiden, kuten anandamidin, nousun jopa 15 kertaa korkeammalle tasolle kuin normaalisti.

Rakenne

Tämä kalvoentsyymi muodostaa homodimeerejä , jotka on osittain erotettu sisäisellä ∼ 9-Å leveällä kanavalla. Metallo -beetalaktamaasiproteiinitaitto on sovitettu yhdistämään kalvon fosfolipideihin . Hydrofobinen ontelo tarjoaa pääsyn NAPE -substraatille aktiiviseen kohtaan, jossa binukleaarinen sinkkikeskus katalysoi sen hydrolyysin. Sappihapot sitoutuvat suurella affiniteetilla tämän ontelon valikoiviin taskuihin, mikä parantaa dimeerikokoonpanoa ja mahdollistaa katalyysin. NAPE-PLD helpottaa sappihapposignaalien ja lipidiamidisignaalien välistä ylikuulumista .

Viitteet