Fuusioproteiini - Fusion protein
Fuusioproteiinit tai kimeeriset (kī-ˈmir-ik) proteiinit (kirjaimellisesti eri lähteistä peräisin olevista osista) ovat proteiineja, jotka on luotu yhdistämällä kaksi tai useampia geenejä, jotka alun perin koodattiin erillisille proteiineille. Tämän fuusiogeenin kääntäminen johtaa yhteen tai useampaan polypeptidiin, joilla on toiminnallisia ominaisuuksia, jotka on johdettu kustakin alkuperäisestä proteiinista. Rekombinantti -fuusioproteiinit luodaan keinotekoisesti yhdistelmä -DNA -tekniikalla käytettäväksi biologisessa tutkimuksessa tai terapiassa . Kimeeriset tai kimeerit tarkoittavat yleensä hybridiproteiineja, jotka on valmistettu polypeptideistä, joilla on erilaiset toiminnot tai fysikaalis-kemialliset mallit. Kimeerisiä mutanttiproteiineja esiintyy luonnostaan, kun monimutkainen mutaatio , kuten kromosomin translokaatio , tandem -päällekkäisyys tai uudelleensijoittaminen, luo uuden koodaussekvenssin, joka sisältää osia kahden eri geenin koodaavista sekvensseistä. Luonnossa esiintyviä fuusioproteiineja esiintyy yleisesti syöpäsoluissa, joissa ne voivat toimia onkoproteiineina . Bcr-abl-fuusioproteiinia on hyvin tunnettu esimerkki onkogeenisen fuusioproteiinin, ja pidetään ensisijaisena onkogeenisiä kuljettaja krooninen myelooinen leukemia .
Toiminnot
Jotkut fuusioproteiinit yhdistävät kokonaisia peptidejä ja sisältävät siksi alkuperäisten proteiinien kaikki toiminnalliset alueet . Kuitenkin muut fuusioproteiinit, erityisesti ne, joita esiintyy luonnossa, yhdistävät vain osia koodaavista sekvensseistä eivätkä siksi säilytä niitä muodostavien vanhempigeenien alkuperäisiä toimintoja.
Monet kokonaiset geenifuusiot ovat täysin toimivia ja voivat silti korvata alkuperäiset peptidit. Jotkut kuitenkin kokevat vuorovaikutusta näiden kahden proteiinin välillä, mikä voi muuttaa niiden toimintoja. Näiden vaikutusten lisäksi jotkin geenifuusiot voivat aiheuttaa sääntelymuutoksia, jotka muuttavat milloin ja missä nämä geenit toimivat. Ja osittainen geenifuusioita , sekoittaminen eri aktiivisten kohtien ja sitovat domeenit on mahdollista johtaa uusia proteiineja, joilla on uusia funktioita.
Fluoresoivat proteiinitunnisteet
Fluoresoivien merkkien fuusio isäntäsolun proteiineihin on laajalti suosittu tekniikka, jota käytetään kokeellisissa solu- ja biologiatutkimuksissa proteiinien vuorovaikutusten seuraamiseksi reaaliajassa. Ensimmäinen fluoresoiva tunniste, vihreä fluoresoiva proteiini (GFP), eristettiin Aequorea Victoriasta ja sitä käytetään edelleen usein nykyaikaisessa tutkimuksessa. Uusimpia johtopäätöksiä ovat valokuvamuunnettavat fluoresoivat proteiinit (PCFP), jotka eristettiin ensimmäisen kerran Anthozoasta . Yleisimmin käytetty PCFP on Kaede- fluoresoiva tunniste, mutta Kikumen vihreänpunaisen (KikGR) kehittäminen vuonna 2005 tarjoaa kirkkaamman signaalin ja tehokkaamman valokuvamuunnoksen. PCFP -loisteputkien käytön etuna on kyky seurata päällekkäisten biokemiallisten reittien vuorovaikutusta reaaliajassa. Tunniste vaihtaa värin vihreästä punaiseksi, kun proteiini saavuttaa kiinnostavan kohdan reitillä, ja vaihtoehtoista värillistä proteiinia voidaan seurata reitin keston ajan. Tämä tekniikka on erityisen hyödyllinen tutkittaessa G-proteiinikytkettyjä reseptoreita (GPCR) kierrätysreittejä. Kierrätettyjen G-proteiinireseptorien kohtalot voidaan joko lähettää plasmamembraanille kierrätettäväksi, merkitä vihreällä fluoresoivalla tunnisteella tai lähettää lysosomiin hajoamista varten, joka on merkitty punaisella fluoresoivalla merkillä.
Kimeeriset proteiinilääkkeet
Fuusioproteiinien luomisen tarkoitus lääkkeen kehittämisessä on antaa ominaisuuksiltaan kustakin "emoproteiinista" tuloksena olevaan kimeeriseen proteiiniin. Useat kimeerinen proteiini huumeet ovat tällä hetkellä saatavilla lääketieteelliseen käyttöön.
Monet kimeeriset proteiinilääkkeet ovat monoklonaalisia vasta -aineita, joiden spesifisyys kohdemolekyylille kehitettiin käyttämällä hiiriä ja siksi ne olivat aluksi "hiiren" vasta -aineita. Muina kuin ihmisproteiineina hiiren vasta-aineilla on taipumus aiheuttaa immuunireaktioita, jos niitä annetaan ihmisille. Kimerisointiprosessi käsittää vasta -ainemolekyylin segmenttien korvaamisen suunnittelun, joka erottaa sen ihmisen vasta -aineesta. Esimerkiksi ihmisen vakioalueita voidaan tuoda, jolloin eliminoidaan suurin osa lääkkeen mahdollisesti immunogeenisistä osista muuttamatta sen spesifisyyttä aiotulle terapeuttiselle kohteelle. Vasta-nimikkeistö osoittaa tämän tyyppinen modifikaatio lisäämällä -xi- osaksi yleisnimi (esim abci- xi -mab ). Jos muuttuvien domeenien osat korvataan myös ihmisen osilla, saadaan humanisoituja vasta -aineita. Vaikka ei käsitteellisesti eri kimeerien, tämän tyyppinen on osoitettu käyttäen -zu- kuten dacli- zu -mab . Katso lisää esimerkkejä monoklonaalisten vasta -aineiden luettelosta.
Kimeeristen ja humanisoitujen vasta -aineiden lisäksi kimeeristen rakenteiden luomiseksi on muitakin farmaseuttisia tarkoituksia. Esimerkiksi etanersepti on TNFa -salpaaja , joka on luotu yhdistämällä tuumorinekroositekijäreseptori (TNFR) ja immunoglobuliini G 1 Fc -segmentti . TNFR tarjoaa spesifisyyttä lääkeaineelle ja vasta -aineen Fc -segmentin uskotaan lisäävän lääkkeen vakautta ja vapautumista. Muita kimeerisiä proteiineja, joita käytetään terapeuttisiin sovelluksiin, ovat:
- Aflibersepti : Ihmisen yhdistelmäproteiini, joka auttaa oksaliplatiiniresistentin metastaattisen paksusuolisyövän , neovaskulaarisen silmänpohjan rappeutumisen ja makulaturvotuksen hoidossa .
- Rilonasepti : Vähentää tulehdusta estämällä IL-1-reseptorien aktivoitumista kryopyriiniin liittyvien jaksottaisten oireyhtymien (CAPS) hoitoon .
- Alefacept : Säädetyt T- soluvasteet kohdistamalla valikoivasti efektorimuistin T-soluja psoriasiksen vulgariksen hoitoon .
- Romiplostim : Peptikeho, joka hoitaa immuunitrombosytopeniaa .
- Abatasepti / belatasepti : häiritsee T-solujen yhteisstimulaatiota autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman , nivelpsoriaasin ja psoriaasin , hoitoon .
- Denileukin-diftitox : hoitaa ihon lymfoomaa .
Rekombinanttitekniikka
Rekombinanttifuusioproteiinin on proteiini luotu geenitekniikan fuusio geenin. Tämä tyypillisesti liittyy poistamalla stop- kodoni peräisin cDNA- sekvenssin, joka koodaa ensimmäistä proteiinia, sitten liittämällä cDNA-sekvenssi toisen proteiinin kehyksessä kautta ligaatiolla tai limittäistä PCR-pidennystä . Että DNA-sekvenssi on sitten ilmaistaan jonka solu yhtenä proteiini. Proteiini voidaan suunnitella siten, että se sisältää molempien alkuperäisten proteiinien koko sekvenssin tai vain osan kummastakin.
Jos nämä kaksi kokonaisuutta ovat proteiineja, usein lisätään myös linkkeri (tai "välike") peptidejä, mikä tekee todennäköisemmäksi, että proteiinit taittuvat itsenäisesti ja käyttäytyvät odotetusti. Erityisesti siinä tapauksessa, että linkkerit mahdollistavat proteiinien puhdistuksen , proteiini- tai peptidifuusioissa olevat linkkerit on joskus suunniteltu katkaisukohdilla proteaaseille tai kemiallisille aineille, jotka mahdollistavat kahden erillisen proteiinin vapautumisen. Tätä tekniikkaa käytetään usein proteiinien tunnistamiseen ja puhdistamiseen sulattamalla GST-proteiini , FLAG-peptidi tai heksa-his-peptidi (6xHis-tag), joka voidaan eristää käyttämällä nikkeli- tai kobolttihartsien affiniteettikromatografiaa . Di- tai multimeerisiä kimeerisiä proteiineja voidaan valmistaa geenitekniikan avulla fuusioimalla peptididomeenien alkuperäisiin proteiineihin, jotka indusoivat keinotekoista proteiinidi- tai multimerisaatiota (esim. Streptavidiini- tai leusiinivetoketjut ). Fuusioproteiineja voidaan valmistaa myös niihin liitettyjen toksiinien tai vasta -aineiden avulla sairauden kehittymisen tutkimiseksi. Hydrogenaasipromoottoria, P SH: tä , tutkittiin P SH- promoottori- gfp- fuusion rakentamisesta käyttämällä vihreää fluoresoivaa proteiinia ( gfp) reportterigeeniä .
Yhdistelmätoiminto
Uudet yhdistelmäteknologiat ovat mahdollistaneet fuusioproteiinin suunnittelun parantamisen käytettäväksi niin monilla aloilla kuin biologinen havaitseminen, paperi- ja elintarviketeollisuus sekä biolääkkeet. Viimeaikaiset parannukset ovat sisältäneet yksittäisten peptidien tai proteiinifragmenttien fuusion olemassa olevien proteiinien alueille, kuten N- ja C -terminaalit , ja niiden tiedetään lisäävän seuraavia ominaisuuksia:
- Katalyyttinen tehokkuus : Tiettyjen peptidien fuusio mahdollistaa suuremman katalyyttisen tehokkuuden muuttamalla kohdeproteiinin tertiääristä ja kvaternaarista rakennetta .
- Liukoisuus : Yleinen haaste fuusioproteiinin suunnittelussa on kysymys vasta syntetisoitujen fuusioproteiinien liukenemattomuudesta yhdistelmä-isännässä, mikä johtaa kohdeproteiinin liialliseen aggregaatioon solussa. Molekyylikaperoneja , jotka kykenevät auttamaan proteiinin taittamisessa, voidaan lisätä, mikä erottaa paremmin hydrofobiset ja hydrofiiliset vuorovaikutukset liuenneessa aineessa proteiinin liukoisuuden lisäämiseksi.
- Lämmönkestävyys : Yksittäisiä peptidejä tai proteiinifragmentteja lisätään tyypillisesti kohdeproteiinin N- tai C -pään joustavuuden vähentämiseksi, mikä vahvistaa lämpöstabiilisuutta ja vakauttaa pH -alueen .
- Entsyymiaktiivisuus: Fuusioita, joihin liittyy vety sidosten lisäämistä, voidaan käyttää entsyymiaktiivisuuden laajentamiseen.
- Ekspressiotasot: Lukuisten fuusiofragmenttien, kuten maltoosia sitovan proteiinin (MBP) tai pienen ubikvitiinin kaltaisen molekyylin ( SUMO ), lisääminen parantaa entsyymin ilmentymistä ja kohdeproteiinin eritystä.
- Immobilisaatio: PHA -syntaasi, entsyymi, joka mahdollistaa kiinnostuksen kohteena olevien proteiinien immobilisoinnin, on tärkeä fuusiomerkki teollisessa tutkimuksessa.
- Kristallien laatu: Kristallien laatua voidaan parantaa lisäämällä kovalenttisia linkkejä proteiinien välille, mikä auttaa rakenteen määritystekniikoissa.
Rekombinantti proteiinisuunnittelu
Yhdistelmäproteiinisuunnittelun varhaisimmat sovellukset voidaan dokumentoida yksittäisten peptidimerkintöjen käytöllä proteiinien puhdistamiseen affiniteettikromatografiassa . Siitä lähtien erilaisia fuusioproteiinisuunnittelutekniikoita on kehitetty sovelluksille, jotka ovat niin erilaisia kuin fluoresoivat proteiinitunnisteet yhdistelmä -fuusioproteiinilääkkeille. Kolme yleisesti käytettyä suunnittelutekniikkaa ovat tandem-fuusio, verkkotunnuksen lisäys ja translaation jälkeinen konjugaatio.
Tandem -fuusio
Kiinnostavat proteiinit on yksinkertaisesti kytketty päästä päähän fuusioimalla N- tai C-päät proteiinien välillä. Tämä tarjoaa joustavan siltarakenteen, joka mahdollistaa riittävästi tilaa fuusiokumppaneiden välillä oikean taittumisen varmistamiseksi . Peptidin N- tai C-päät ovat kuitenkin usein ratkaisevia komponentteja halutun taittumiskuvion saamiseksi yhdistelmäproteiinille, mikä tekee domeenien yksinkertaisesta päästä päähän yhdistämisestä tehotonta tässä tapauksessa. Tästä syystä proteiinilinkkeriä tarvitaan usein mielenkiinnon kohteena olevien proteiinialueiden toimivuuden ylläpitämiseksi.
Verkkotunnuksen lisäys
Tämä tekniikka sisältää peräkkäisten proteiinidomeenien fuusion koodaamalla halutut rakenteet yhdeksi polypeptidiketjuksi, mutta joskus se saattaa vaatia domeenin lisäämisen toiseen domeeniin. Tämä tekniikka on tyypillisesti vaikeampaa toteuttaa kuin tandem -fuusio, koska vaikeuksia löytää sopiva ligaatiokohta kiinnostavasta geenistä.
Translaation jälkeinen konjugaatio
Tämä tekniikka yhdistää proteiinidomeenit kiinnostuksen kohteena olevien proteiinien ribosomaalisen translaation jälkeen, toisin kuin geneettinen fuusio ennen muissa yhdistelmätekniikoissa käytettyä translaatiota.
Proteiinin linkittäjät
Proteiinilinkkerit auttavat fuusioproteiinien suunnittelua tarjoamalla sopivat välit domeenien välillä ja tukevat proteiinin oikeaa taittumista siinä tapauksessa, että N- tai C -terminaaliset vuorovaikutukset ovat ratkaisevia taittumisen kannalta. Yleensä proteiinilinkkerit mahdollistavat tärkeät domeenivuorovaikutukset, vahvistavat vakautta ja vähentävät steerisiä esteitä, mikä tekee niistä edullisia käytettäväksi fuusioproteiinien suunnittelussa, vaikka N- ja C -päät voidaan yhdistää. Kolme päätyyppiä linkereitä ovat joustavia, jäykkiä ja katkaistavia in vivo.
- Joustavat linkkerit voivat koostua monista pienistä glysiinitähteistä , jolloin ne voivat käpristyä dynaamiseen, mukautuvaan muotoon.
- Jäykät linkkerit voivat muodostua suurista, syklisistä proliinitähteistä , mikä voi olla hyödyllistä, kun on säilytettävä erittäin spesifinen etäisyys domeenien välillä.
- In vivo -hajotettavat linkkerit ovat ainutlaatuisia siinä mielessä , että ne on suunniteltu sallimaan yhden tai useamman fuusioituneen domeenin vapautuminen tietyissä reaktio -olosuhteissa, kuten spesifisessä pH -gradientissa tai joutuessaan kosketuksiin toisen solun biomolekyylin kanssa.
Luonnollinen esiintyminen
Luonnossa esiintyvät fuusiogeenit luodaan yleisimmin, kun kromosomaalinen translokaatio korvaa yhden geenin terminaaliset eksonit ehjillä eksoneilla toisesta geenistä. Tämä luo yhden geenin, joka voidaan kopioida , silmukoida ja kääntää toiminnallisen fuusioproteiinin tuottamiseksi. Monet tärkeät syöpää edistävät onkogeenit ovat tällä tavalla tuotettuja fuusiogeenejä.
Esimerkkejä ovat:
Vasta -aineet ovat fuusioproteiineja, jotka on tuotettu V (D) J -rekombinaatiolla .
On myös harvinaisia esimerkkejä luonnossa esiintyvistä polypeptideistä, jotka näyttävät olevan kahden selkeästi määritellyn moduulin fuusio, jossa jokaisella moduulilla on ominainen aktiivisuutensa tai tehtävänsä toisistaan riippumatta. Kaksi merkittävää esimerkkiä ovat: kaksinkertainen PP2C-kimera Plasmodium falciparumissa (malarialoinen), jossa jokaisella PP2C-moduulilla on proteiinifosfataasi 2C -entsymaattinen aktiivisuus, ja kaksiperheiset immunofiliinit, joita esiintyy useissa yksisoluisissa organismeissa (kuten alkueläinloisissa ja Flavobacteria-bakteereissa) ) ja sisältävät täyspitkiä Cyclophilin- ja FKBP-chaperone-moduuleja. Tällaisen kimeran evoluution alkuperä on edelleen epäselvä.
Katso myös
Viitteet
Ulkoiset linkit
|
Kirjastoresursseja noin Fuusioproteiinitasot |
- Mutantti+kimeeriset+proteiinit Yhdysvaltain kansallisen kirjaston lääketieteellisissä aihealueissa (MeSH)
- ChiPPI : Kimeeristen proteiinien palvelinproteiini-proteiini-vuorovaikutus.