Lusiferaasi - Luciferase

Dinoflagellate Lusiferaasin katalyyttinen alue
lingferaasidomeenin kiderakenne Lingulodinium polyedrumin dinoflagellaatista
Tunnisteet
Symboli	Luciferase_cat
Pfam	PF10285
InterPro	IPR018804
Saatavilla olevat proteiinirakenteet: Pfam   rakenteet / ECOD   ATE RCSB ATE ; PDBe ; PDBj ATE rakenteen yhteenveto

Lusiferaasi on yleinen termi bioluminesenssia tuottavien oksidatiivisten entsyymien luokalle , ja se erotetaan yleensä fotoproteiinista . Nimeä käytti ensimmäisenä Raphaël Dubois, joka keksi sanat lusiferiini ja lusiferaasi entsyymille . Molemmat sanat ovat peräisin latinan sanasta lucifer , joka tarkoittaa "lightbearer", joka puolestaan on peräisin latinan sanoista "kevyt" ( LUX) ja "tuoda tai kantaa" ( Ferre) .

Firefly -lusiferaasi
Photinus pyralis firefly -lusiferaasin rakenne .
Tunnisteet
Organismi	Photinus pyralis
Symboli	Firefly -lusiferaasi
ATE	1LCI Lisää rakenteita
UniProt	P08659
Muut tiedot
EY -numero	1.13.12.7
Etsiä Rakenteet Sveitsiläinen malli Verkkotunnukset InterPro

Lusiferaaseja käytetään laajalti biotekniikassa , mikroskopiassa ja reportterigeeneinä monissa samoissa sovelluksissa kuin fluoresoivia proteiineja . Kuitenkin, toisin kuin fluoresoivat proteiinit, lusiferaasit eivät vaadi ulkoista valonlähdettä , mutta edellyttävät kulutettavan substraatin lusiferiinin lisäämistä .

Esimerkkejä

Erilaiset organismit säätelevät valontuotantoaan käyttämällä erilaisia ​​lusiferaaseja erilaisissa valoa emittoivissa reaktioissa. Suurin osa tutkituista lusiferaaseista on löydetty eläimistä, mukaan lukien tulikärpät , ja monista merieläimistä, kuten käpälöistä , meduusoista ja merirosvoista . Lusiferaaseja on kuitenkin tutkittu valosienissä, kuten Jack-O-Lantern-sienessä , sekä esimerkkejä muissa valtakunnissa, mukaan lukien valobakteerit ja dinoflagelaatit .

Firefly ja napsauta kovakuoriainen

Lusiferaaseja Fireflies - joita on yli 2000 lajia - ja muiden seppämäiset (klikkaa kovakuoriaiset ja sukulaisia yleensä) ovat monipuolisia tarpeeksi käyttökelpoisia molekyyli- fylogenia . Tulikärpäsissä tarvittava happi syötetään vatsan putken kautta, jota kutsutaan vatsan henkitorveksi . Yksi hyvin tutkittu lusiferaasi on Photinini firefly Photinus pyralis , jonka optimaalinen pH on 7,8.

Meren orvokki

Myös hyvin tutkittu on meri -orvokki , Renilla reniformis . Tässä organismissa lusiferaasi ( Renilla-lusiferiini-2-mono-oksigenaasi ) liittyy läheisesti lusiferiinia sitovaan proteiiniin sekä vihreään fluoresoivaan proteiiniin ( GFP ). Kalsium laukaisee lusiferiinin ( koelenteratsiinin ) vapautumisen lusiferiinia sitovasta proteiinista. Substraatti on sitten saatavana hapetettavaksi lusiferaasilla, jossa se hajoaa koelenteramidiksi, jolloin syntyy energiaa. GFP: n puuttuessa tämä energia vapautuisi sinisen valon fotonina (huippupäästöaallonpituus 482 nm). Kuitenkin läheisesti liittyvän GFP: n vuoksi lusiferaasin vapauttama energia kytkeytyy sen sijaan resonanssienergian siirron kautta GFP: n fluoroforiin ja vapautuu myöhemmin vihreän valon fotonina (emissiohuippuhuippu 510 nm). Katalysoitu reaktio on:

• koelenteratsiini + O ₂ → koelenteramidi + CO ₂ + valon fotoni

Copepod

Uusia lusiferaaseja on äskettäin tunnistettu, jotka toisin kuin muut lusiferaasit ovat luonnostaan ​​erittyviä molekyylejä. Yksi tällainen esimerkki on Metridia koelenteratsiini -riippuvaisen lusiferaasi (MetLuc, A0A1L6CBM1 ), joka on peräisin meren hankajalkainen Metridia longa . Metridia longa erittää lusiferaasi-geeni koodaa 24 kDa: n proteiinia, joka sisältää N-terminaalisen erityssignaalisekvenssin peptidin 17 aminohapon tähteitä. Tämän lusiferaasimolekyylin herkkyys ja korkea signaalin voimakkuus ovat hyödyllisiä monissa reportteritutkimuksissa. Jotkut MetLucin kaltaisen eritetyn reportterimolekyylin käytön eduista ovat sen ei-hajoamisprotokolla, jonka avulla voidaan suorittaa elävien solujen määrityksiä ja useita määrityksiä samassa solussa.

Bakteeri

Bakteerien bioluminesenssi näkyy Photobacterium -lajeissa, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi ja Vibrio harveyi . Valoemission joissakin bioluminesoivat bakteerit ssa hyödynnetään 'antenni', kuten lumazine proteiini hyväksyä energiaa ensisijainen viritystila on lusiferaasi, tuloksena on kiihtynyt lulnazine kromoforin , joka säteilee valoa, joka on lyhyempi aallonpituus (enemmän sininen), kun taas toisissa käytä keltaista fluoresoivaa proteiinia (YFP), jonka kromoforina on FMN ja joka lähettää punaista siirtymää verrattuna lusiferaasin valoon.

Dinoflagellate

Panssarilevä lusiferaasi on moni- verkkotunnuksen eukaryootti -proteiinin, joka koostuu N-terminaalisen domeenin, ja kolme katalyyttisiä domeeneja , joista kukin edeltää heeliksnipun verkkotunnuksen. Rakenne Panssarilevän lusiferaasin katalyyttinen domeeni on ratkaistu. Ydinosa verkkotunnuksen on 10 kerrattu beeta-sylinterin , joka on rakenteellisesti samanlainen kuin Lipokaliinien ja FABP . N-terminaalinen domeeni on säilynyt dinoflagellate-lusiferaasin ja lusiferiinia sitovien proteiinien (LBP: t) välillä. On ehdotettu, että tämä alue voi välittää vuorovaikutusta LBP: n ja lusiferaasin välillä tai niiden yhdistämisen vakuolikalvoon . Kierteisellä nippualueella on kolme kierre -nippurakennetta , joka sisältää neljä tärkeää histidiiniä , joiden uskotaan vaikuttavan entsyymin pH -säätelyyn . Dinoflagellate-lusiferaasin β-tynnyrissä on suuri tasku pH-arvossa 8 tetrapyrrolisubstraatin sijoittamiseksi, mutta siinä ei ole aukkoa substraatin pääsemiseksi sisään. Siksi on tapahduttava merkittävä konformaatiomuutos, jotta ligandille pääsee ja tilaa aktiivisessa kohdassa, ja tämän muutoksen lähde on neljän N-terminaalisen histidiinitähteen kautta. PH 8: ssa voidaan nähdä, että protonoimattomat histidiinitähteet ovat mukana vetysidosten verkostossa nipun heliksien rajapinnalla, jotka estävät substraatin pääsyn aktiiviseen kohtaan ja häiritsevät tätä vuorovaikutusta protonoimalla (pH 6,3) tai korvaamalla histidiinitähteet alaniinilla aiheuttaa nipun suuren molekyyliliikkeen, joka erottaa heliksit 11 A: lla ja avaa katalyyttikohdan. Loogisesti ottaen histidiinitähteitä ei voida luonnossa korvata alaniinilla, mutta tämä kokeellinen korvaus vahvistaa edelleen, että suuret histidiinitähteet estävät aktiivisen kohdan. Lisäksi kolme Gly-Gly-sekvenssiä, yksi N-terminaalisessa kierukassa ja kaksi kierre-silmukka-helix-motiivissa, voivat toimia saranoina, joiden ympärillä ketjut pyörivät, avatakseen edelleen reitin katalyyttikohtaan ja suurentaakseen aktiivista sivusto.

Dinoflagellate-lusiferaasi kykenee lähettämään valoa, koska se on vuorovaikutuksessa substraatinsa ( lusiferiini ) ja lusiferiinia sitovan proteiinin (LBP) kanssa dinoflagellaateissa olevissa scintillon- organelleissa . Lusiferaasi toimii lusiferiinin ja LBP: n mukaisesti valoa lähettäen, mutta jokainen komponentti toimii eri pH: ssa. Lusiferaasi ja sen domeenit eivät ole aktiivisia pH: ssa 8, mutta ne ovat erittäin aktiivisia optimaalisella pH: lla 6,3, kun taas LBP sitoo lusiferiinin pH: ssa 8 ja vapauttaa sen pH: ssa 6,3. Näin ollen lusiferiini vapautuu reagoimaan aktiivisen lusiferaasin kanssa vain, kun scintillon tehdään happamaksi pH -arvoon 6,3. Siksi pH: n alentamiseksi avataan scintillon- kalvon jänniteohjatut kanavat, jotta protonit pääsevät sisään tyhjiöstä, jolla on mekaanisesta stimulaatiosta syntyvä toimintapotentiaali . Näin ollen voidaan nähdä, että vacuolar -kalvon toimintapotentiaali johtaa happamoitumiseen ja tämä puolestaan ​​sallii lusiferiinin vapautumisen reagoida lusiferaasin kanssa scintillonissa, jolloin syntyy sinistä valoa.

Reaktion mekanismi

Kaikki lusiferaasit luokitellaan oksidoreduktaaseiksi ( EC 1.13.12.- ), mikä tarkoittaa, että ne vaikuttavat yksittäisiin luovuttajiin sisältäen molekyylihapen. Koska lusiferaasit ovat peräisin monista erilaisista proteiiniperheistä, jotka eivät liity toisiinsa, yhdistävää mekanismia ei ole, koska mikä tahansa mekanismi riippuu lusiferaasin ja lusiferiinin yhdistelmästä. Kuitenkin, kaikki tunnettu lusiferaasi-lusiferiini reaktioita mennessä on osoitettu vaatia molekulaarisen hapen jossain vaiheessa.

Bakteeri -lusiferaasi

Bakteeri -lusiferaasin katalysoima reaktio on myös hapettava prosessi:

• FMNH ₂ + O ₂ + RCHO → FMN + RCOOH + H ₂ O + valo

Reaktiossa molekyylihappi hapettaa flaviinimononukleotidin ja pitkäketjuisen alifaattisen aldehydin alifaattiseksi karboksyylihapoksi . Reaktio muodostaa viritetyn hydroksiflaviinivälituotteen, joka dehydratoidaan tuotteeksi FMN sinivihreän valon lähettämiseksi.

Lähes kaikki reaktioon syötetty energia muuttuu valoksi. Reaktio on 80-90% tehokas. Vertailun vuoksi hehkulamppu muuttaa vain noin 10% energiasta valoon ja 150 lumenia/Watt (lm/W) LED muuttaa 20% syötetystä energiasta näkyväksi valoksi.

Sovellukset

Lusiferaaseja voidaan tuottaa laboratoriossa geenitekniikan avulla useisiin tarkoituksiin. Lusiferaasi geenejä voidaan syntetisoida ja insertoida organismien tai transfektoitu soluihin. Vuodesta 2002 lähtien hiiret , silkkiäistoukat ja perunat ovat vain muutamia organismeista, jotka on jo suunniteltu tuottamaan proteiinia.

In lusiferaasireaktion, valo säteilee, kun lusiferaasia vaikuttaa sopiva lusiferiini substraatin . Fotoniemissio voidaan havaita valoherkillä laitteilla, kuten luminometrillä tai muunnetuilla optisilla mikroskoopeilla . Tämä mahdollistaa biologisten prosessien tarkkailun. Koska valoherätystä ei tarvita lusiferaasin bioluminesenssille, autofluoresenssi on minimaalinen ja siten käytännössä taustavapaa fluoresenssi. Siksi vain 0,02 pg voidaan silti mitata tarkasti käyttämällä tavallista tuikelaskuria .

Biologisessa tutkimuksessa lusiferaasia käytetään yleisesti reportterina transkription aktiivisuuden arvioimiseksi soluissa, jotka on transfektoitu lusiferaasigeenin sisältävällä geneettisellä rakenteella kiinnostuksen kohteena olevan promoottorin ohjauksessa . Lisäksi proluminoivia molekyylejä, jotka muutetaan lusiferiiniksi tietyn entsyymin aktiivisuuden jälkeen, voidaan käyttää entsyymiaktiivisuuden havaitsemiseen kytketyissä tai kaksivaiheisissa lusiferaasimäärityksissä. Tällaisia ​​substraatteja on käytetty muun muassa kaspaasiaktiivisuuden ja sytokromi P450 -aktiivisuuden havaitsemiseen .

Lusiferaasi voidaan myös käyttää havaitsemaan tason solun ATP solujen elinkelpoisuuden määritykset tai kinaasiaktiivisuuden määrityksissä. Lusiferaasi voi toimia ATP -anturiproteiinina biotinylaation kautta . Biotinylointi on immobilisoida lusiferaasin solun pinnalla sitoutumalla streptavidiini - biotiini monimutkainen. Tämä mahdollistaa lusiferaasin havaita ATP: n ulosvirtauksen solusta ja näyttää tehokkaasti ATP: n reaaliaikaisen vapautumisen bioluminesenssin kautta. Lusiferaasi voidaan lisäksi tehdä herkempi ATP: n mittausreagenssia lisäämällä luminesenssin intensiteetti muuttamalla tiettyjen aminohappo- tähteiden sekvenssin proteiinin.

Kokonaisten eläinten kuvantaminen (kutsutaan in vivo elävänä tai, toisin sanoen ex vivo -kuvaus) on tehokas tekniikka solupopulaatioiden tutkimiseksi elävissä eläimissä, kuten hiirissä. Erilaisia ​​solutyyppejä (esim. Luuytimen kantasolut, T-solut) voidaan suunnitella ilmentämään lusiferaasia, joka mahdollistaa niiden ei-invasiivisen visualisoinnin elävän eläimen sisällä käyttämällä herkkää varausparikameran kameraa ( CCD-kamera ). seurata tuumorigeneesiä ja kasvainten hoitovastetta eläinmalleissa. Ympäristötekijät ja terapeuttiset häiriöt voivat kuitenkin aiheuttaa eroja kasvaimen taakan ja bioluminesenssin voimakkuuden välillä suhteessa proliferatiivisen aktiivisuuden muutoksiin. In vivo -kuvauksella mitattu signaalin voimakkuus voi riippua useista tekijöistä, kuten D-lusiferiinin imeytymisestä vatsakalvon kautta, verenkierrosta, solukalvon läpäisevyydestä, tekijöiden saatavuudesta, solunsisäisestä pH: sta ja peittävän kudoksen läpinäkyvyydestä. lusiferaasin määrä.

Lusiferaasi on lämpöherkkä proteiini, jota käytetään proteiinien denaturaatiotutkimuksissa ja testataan lämpöshokkiproteiinien suojakykyä . Lusiferaasin käyttömahdollisuudet laajenevat edelleen.

Katso myös

• Luciferin
• Bioluminesenssikuvaus
• Koorumin tunnistaminen
• Bioluminesoivat bakteerit

Viitteet

Ulkoiset linkit