Uudelleenohjelmointi - Reprogramming
Biologiassa uudelleenohjelmointi viittaa epigeneettisten merkkien, kuten DNA -metylaation , poistamiseen ja uudelleenmuodostamiseen nisäkkäiden kehityksen aikana tai soluviljelmässä. Tällainen ohjaus liittyy usein myös vaihtoehtoisiin histonien kovalenttisiin modifikaatioihin .
Uudelleenohjelmoinnit, jotka ovat laajamittaisia (10% - 100% epigeneettisistä merkkeistä) ja nopeita (tunneista muutamaan päivään), esiintyvät nisäkkäiden kolmessa elämänvaiheessa. Lähes 100% epigeneettisen merkkejä uudelleen ohjelmoida kahden lyhyen aikaa varhaisessa kehitysvaiheessa jälkeen hedelmöityksen , joka munasolu , jonka sperma . Lisäksi lähes 10% hippokampuksen neuronien DNA -metylaatioista voidaan muuttaa nopeasti vahvan pelomuistin muodostumisen aikana.
Hedelmöityksen jälkeen nisäkkäillä DNA-metylaatiomallit poistetaan suurelta osin ja palautetaan sitten alkion alkuvaiheen aikana. Lähes kaikki vanhempien metylaatiot poistetaan, aluksi alkion alkuvaiheessa ja jälleen gametogeneesissä , jolloin demetylaatio ja remetylaatio tapahtuvat joka kerta. Demetylaatio alkion alkuvaiheessa tapahtuu implantaatiota edeltävänä aikana. Kun siittiö siittiöiden hedelmöittää munasolun muodostamaan tsygootin , isän DNA: n nopea DNA -demetylaatio ja äidin DNA: n hitaampi demetylaatio tapahtuu, kunnes muodostuu morula, jolla ei ole lainkaan metylaatiota. Sen jälkeen, kun blastokysti on muodostettu, metylaatio voi alkaa, ja tällöin muodostuu epiblast aalto metylaation tapahtuu sitten, kunnes istutuksen vaiheessa alkio. Toinen nopean ja lähes täydellisen demetylaation ajanjakso tapahtuu gametogeneesin aikana alkukantaisissa itusoluissa (PGC). Muut kuin PGC: t implantaation jälkeisessä vaiheessa somaattisten solujen metylaatiomallit ovat vaihe- ja kudosspesifisiä, ja muutokset muuttavat oletettavasti kunkin yksittäisen solutyypin ja kestävät vakaasti pitkän ajan.
Alkion kehitys
Hiiren siittiöiden genomi on 80–90% metyloitu sen CpG -kohdissa DNA: ssa, mikä on noin 20 miljoonaa metyloitua kohtaa. Jälkeen lannoitus , isän kromosomista on lähes kokonaan demetyloidaan kuuden tunnin aktiivinen prosessi, ennen DNA: n replikaation (sininen viiva kuviossa). Kypsä oosyytin , noin 40% sen CpG-kohtien on metyloitu. Äidin kromosomin demetylaatio tapahtuu suurelta osin estämällä metyloivia entsyymejä toimimasta äidin alkuperän DNA: han ja laimentamalla metyloitua äidin DNA: ta replikaation aikana (punainen viiva kuvassa). Morula (klo 16 solun vaiheessa), on vain pieni määrä DNA: n metylaatio (musta viiva kuviossa). Metylaatio alkaa lisääntyä 3,5 päivää hedelmöityksen jälkeen blastosystissä , ja suuri metylaatioaalto tapahtuu sitten päivinä 4,5-5,5 epiblastissa , siirtyy 12%: sta 62%: iin metylaatiosta ja saavuttaa suurimman tason istutuksen jälkeen kohtuun. Seitsemäntenä päivänä hedelmöityksen jälkeen istutetussa alkiossa olevat vasta muodostuneet alkukantaiset itusolut (PGC) erottuvat jäljellä olevista somaattisista soluista . Tässä vaiheessa PGC: llä on suunnilleen sama metylaatiotaso kuin somaattisilla soluilla.
Äskettäin muodostuneet alkukantaiset itusolut (PGC) istutetussa alkiossa hajoavat somaattisista soluista. Tässä vaiheessa PGC: llä on korkea metylaatiotaso. Nämä solut siirtyvät epiblastista sukupuolielinten harjaa kohti . Nyt solut lisääntyvät nopeasti ja alkavat demetylaatiota kahdessa aallossa. Ensimmäisessä aallossa demetylaatio tapahtuu replikatiivisella laimennuksella, mutta toisella aallolla demetylaatio tapahtuu aktiivisella prosessilla. Toinen aalto johtaa tiettyjen lokusten demetylaatioon. Tässä vaiheessa PGC -genomit näyttävät kaikkien solujen DNA -metylaation alimmat tasot koko elinkaaren aikana [alkion päivänä 13.5 (E13,5), katso tämän luvun toinen kuva].
Hedelmöityksen jälkeen jotkut äskettäin muodostetun alkion solut siirtyvät ituharjalle ja niistä tulee lopulta seuraavan sukupolven itusolut (siittiöt ja munasolut). Koska ilmiö leimautuminen , äidin ja isän genomit merkitty eri tavalla ja se on asianmukaisesti ohjelmoida uudelleen joka kerta, kun ne kulkevat läpi ituradan. Siksi gametogeneesin aikana alkukantaisten itusolujen alkuperäiset kaksisuuntaiset DNA-metylaatiomallit on poistettava ja vahvistettava uudelleen lähettävän vanhemman sukupuolen perusteella.
Hedelmöityksen jälkeen isän ja äidin genomit demetyloidaan epigeneettisten allekirjoitustensa poistamiseksi ja totipotenssin saavuttamiseksi. Tässä vaiheessa on epäsymmetriaa: urospuolinen pronukleus käy läpi nopean ja aktiivisen demetylaation. Samaan aikaan naaraspuolinen aivot demetyloidaan passiivisesti solujakautumisen aikana. Prosessi DNA-demetylaation käsittää emäksen leikkaus-korjaus ja todennäköisesti muut DNA-korjaus-mekanismeja. Huolimatta tämän prosessin globaalista luonteesta, on tiettyjä sekvenssejä, jotka välttävät sitä, kuten eri tavalla metyloidut alueet (DMRS), jotka liittyvät painettuihin geeneihin, retrotransposoneihin ja sentromeeriseen heterokromatiiniin . Remetylaatiota tarvitaan jälleen, jotta alkio voidaan erottaa täydelliseksi organismiksi.
Implantaatiota edeltävien alkioiden manipuloinnin in vitro on osoitettu häiritsevän metylaatiomalleja painetuissa lokuksissa ja sillä on ratkaiseva rooli kloonatuissa eläimissä.
Oppiminen ja muisti
Oppimisella ja muistilla on pysyvyysasteita, jotka eroavat muista henkisistä prosesseista, kuten ajattelusta, kielestä ja tietoisuudesta, jotka ovat luonteeltaan väliaikaisia. Oppiminen ja muisti voidaan joko kerätä hitaasti (kertotaulukot) tai nopeasti (koskettaa kuumaa liesiä), mutta kun ne on saavutettu, ne voidaan palauttaa tietoiseen käyttöön pitkään. Rotat, joille on tehty yksi asiayhteyteen perustuva pelonkäsittely, luovat erityisen vahvan pitkäaikaisen muistin. 24 tuntia harjoittelun jälkeen 9,17% hippokampuksen neuronien rotan genomien geeneistä havaittiin erilaiseksi metyloiduksi . Tämä sisälsi yli 2000 eri tavalla metyloitua geeniä 24 tuntia koulutuksen jälkeen, ja yli 500 geeniä demetyloitiin. Aivojen hippokampuksen alueeseen tallennetaan ensin kontekstuaaliset pelomuistot (katso aivojen kuva, tämä osio), mutta tämä varastointi on ohimenevää eikä jää hippokampukseen. Rotilla asiayhteyteen perustuva pelon hoito poistetaan, kun hippokampukselle suoritetaan hippokampektomia vain 1 päivä käsittelyn jälkeen, mutta rotilla säilyy huomattava määrä asiayhteyteen liittyvää pelkoa, kun pitkä viive (28 päivää) asetetaan hoitoajan ja hippokampectomian välille.
Molekyylivaiheet
DNA -metylomin uudelleenohjelmointiin tarvitaan kolme molekyylivaihetta . Vaihe 1: Rekrytointi. Ohjelmointiin tarvittavat entsyymit rekrytoidaan genomikohtiin, jotka vaativat demetylaatiota tai metylaatiota. Vaihe 2: Toteutus. Ensimmäiset entsymaattiset reaktiot tapahtuvat. Metyloinnin tapauksessa tämä on lyhyt vaihe, joka johtaa sytosiinin metylaatioon 5-metyylisytosiiniksi. Vaihe 3: Peruspoiston DNA -korjaus. Demetylaation välituotteet katalysoivat emäksenpoisto -DNA: n korjausreitin spesifiset entsyymit, jotka lopulta palauttavat kystosiinin DNA -sekvenssissä.
Tämän osion kuva osoittaa kymmenen yksitoista translokaatiometyylisytosiinidioksigenaasin (TET) keskeiset roolit 5-metyylisytosiinin demetylaatiossa sytosiinin muodostamiseksi. Kuten vuonna 2018 tarkasteltiin, TET-dioksigenaasit hapetavat aluksi usein 5 mC 5-hydroksimetyylisytosiinin (5hmC) tuottamiseksi. Peräkkäisissä vaiheissa (katso kuva) TET-entsyymit hydroksyloivat edelleen 5hmC: tä, jolloin muodostuu 5-formyylisytosiini (5fC) ja 5-karboksyylisytosiini (5caC). Tymiini-DNA-glykosylaasi (TDG) tunnistaa väliemäkset 5fC ja 5caC ja leikkaa glykosidisidoksen, joka johtaa apyrimidiinikohtaan (AP-kohta). Vaihtoehtoisessa oksidatiivinen deaminaatio reitin, 5hmC voidaan hapettavasti deaminoituu mukaan APOBEC (AID / APOBEC) deaminaaseja muodostamiseksi 5-hydroxymethyluracil (5hmU) tai 5mC voidaan muuntaa tymiini (Thy). 5hmU voidaan katkaista TDG: llä, SMUG1: llä , NEIL1 : llä tai MBD4: llä . AP -kohdat ja T: G -yhteensopimattomuudet korjataan sitten emäksen leikkauskorjaus (BER) -entsyymeillä, jolloin saadaan sytosiini (Cyt).
TET perhe
TET -entsyymien isomuodot sisältävät vähintään kaksi TET1 -isoformia, yhden TET2: sta ja kolme TET3: n isoformia. Täyspitkä kanoninen TET1-isoformi näyttää käytännössä rajoittuvan varhaisiin alkioihin, alkion kantasoluihin ja alkukantaisiin sukusoluihin (PGC). Hallitseva TET1 -isoformi useimmissa somaattisissa kudoksissa, ainakin hiiressä, syntyy vaihtoehtoisesta promoottorin käytöstä, mikä saa aikaan lyhyen transkriptin ja katkaistun TET1 -proteiinin. TET3: n isomuotoja ovat täyspitkä TET3FL -muoto, lyhytmuotoinen silmukointivariantti TET3s ja muoto, joka esiintyy munasoluissa ja neuroneissa, jotka on nimetty TET3o: ksi. TET3o luodaan vaihtoehtoisella promoottorikäytöllä ja se sisältää lisäksi ensimmäisen N-terminaalisen eksonin, joka koodaa 11 aminohappoa. TET3o esiintyy vain munasoluissa ja neuroneissa, eikä sitä ilmennetty alkion kantasoluissa tai missään muussa testatussa solutyypissä tai aikuisen hiirikudoksessa. Vaikka TET1-ilmentymistä tuskin voidaan havaita munasoluissa ja tsygooteissa ja TET2 ilmentyy vain kohtalaisesti, TET3-variantti TET3o osoittaa erittäin korkeaa ekspressiotasoa munasoluissa ja tsygooteissa, mutta se on lähes poissa 2-soluvaiheessa. On mahdollista, että TET3o, jossa on paljon neuroneja, munasoluja ja tsygootteja yhdessä soluvaiheessa, on tärkein TET -entsyymi, jota käytetään, kun näissä soluissa tapahtuu erittäin laajamittaisia nopeita demetylaatioita.
TET: n rekrytointi DNA: han
TET entsyymit eivät sitoudu spesifisesti 5-metyylisytosiini , paitsi kun palvelukseen. Ilman rekrytointia tai kohdistamista TET1 sitoutuu pääasiassa korkeisiin CG-promoottoreihin ja CpG-saariin (CGI) genomin laajuisesti CXXC-verkkotunnuksellaan, joka voi tunnistaa metyloimattomat CGI: t. TET2: lla ei ole affiniteettia 5-metyylisytosiiniin DNA: ssa. Täyspitkän TET3: n CXXC-domeeni, joka on hallitseva muoto neuroneissa, sitoutuu voimakkaimmin CpG: iin, joissa C muutettiin 5-karboksisytosiiniksi (5caC). Se sitoutuu kuitenkin myös metyloimattomiin CpG-yhdisteisiin .
Jotta TET -entsyymi voisi aloittaa demetylaation, se on ensin rekrytoitava metyloituun CpG -kohtaan DNA: ssa. Kaksi proteiinia, joiden on osoitettu värväävän TET -entsyymin DNA: n metyloituun sytosiiniin, ovat OGG1 (ks. Kuva DNA: n demetylaation aloittaminen) ja EGR1 .
OGG1
Oksoguaniiniglykosylaasi (OGG1) katalysoi ensimmäisen vaiheen hapettuneen vaurioituneen emäksen 8-OHdG: n emäksen leikkauskorjauksessa . OGG1 löytää 8-OHdG: n liu'uttamalla lineaarista DNA: ta pitkin 1000 emäsparia DNA: ta 0,1 sekunnissa. OGG1 löytää nopeasti 8-OHdG: n. OGG1 -proteiinit sitoutuvat oksidatiivisesti vaurioituneeseen DNA: han puolen enimmäisajan ollessa noin 6 sekuntia. Kun OGG1 löytää 8-OHdG: n, se muuttaa konformaatiota ja komplekseja 8-OHdG: n kanssa OGG1: n sitoutumistaskussa. OGG1 ei välittömästi poista 8-OHdG: tä. Puoli 8-OHdG: n maksimaalista poistoa kestää noin 30 minuuttia HeLa-soluissa in vitro tai noin 11 minuuttia säteilytettyjen hiirten maksassa. Reaktiivisten happilajien DNA-hapettuminen tapahtuu ensisijaisesti guaniinissa metyloidussa CpG-paikassa, koska 5-metyylisytosiinin vieressä olevien guaniiniemästen ionisaatiopotentiaali on heikentynyt. TET1 sitoo (rekrytoidaan) OGG1: een, joka on sitoutunut 8-OHdG: hen (katso kuva). Tämä todennäköisesti sallii TET1: n demetyloida viereisen metyloidun sytosiinin. Kun ihmisen rintarauhasen epiteelisoluissa (MCF-10A) käsiteltiin H 2 O 2 , 8-OHdG kasvoi DNA: 3,5-kertainen ja tämä aiheutti suuren mittakaavan demetylaation 5-metyylisytosiinin noin 20%: iin sen alkuperäisestä DNA: ssa.
EGR1
Geenin varhaisen kasvun vasteproteiini 1 ( EGR1 ) on välitön varhainen geeni (IEG). IEG: iden määrittelevä ominaisuus on niiden mRNA-tasojen nopea ja ohimenevä ylössäätely-muutamassa minuutissa-riippumatta proteiinisynteesistä. Neuronaalinen aktiivisuus voi nopeasti indusoida EGR1: n. Aikuisuudessa EGR1: tä ekspressoidaan laajalti koko aivoissa säilyttäen perustason ilmentymistasot useilla aivojen keskeisillä alueilla, mukaan lukien mediaalinen prefrontal cortex, striatum, hippocampus ja amygdala. Tämä ilmaisu liittyy kognition, emotionaalisen vasteen, sosiaalisen käyttäytymisen ja palkkaherkkyyden hallintaan. EGR1 sitoutuu DNA: han kohdissa, joiden motiivit ovat 5′-GCGTGGGCG-3 'ja 5'-GCGGGGGCGG-3', ja näitä motiiveja esiintyy pääasiassa geenien promoottorialueilla. Lyhyt isoformi TET1 ilmaistaan aivoissa. EGR1 ja TET1 muodostavat kompleksin, jota välittävät molempien proteiinien C-terminaaliset alueet riippumatta siitä, liittyykö ne DNA: han. EGR1 rekrytoi TET1: itä EGR1: n sitoutumiskohtia reunustaville genomisille alueille. EGR1: n läsnä ollessa TET1: t kykenevät paikkaspesifiseen demetylaatioon ja aktivoimaan EGR1: n säätelemien alavirran geenien ilmentymisen.
Soluviljelyjärjestelmissä
Uudelleenohjelmointi voidaan saada aikaan myös keinotekoisesti lisäämällä eksogeenisiä tekijöitä, yleensä transkriptiotekijöitä . Tässä yhteydessä se viittaa usein indusoitujen pluripotenttisten kantasolujen luomiseen kypsistä soluista, kuten aikuisten fibroblasteista . Tämä mahdollistaa tuotannon kantasolujen varten biolääketieteellisen tutkimuksen , kuten tutkimus kantasoluterapian , ilman alkioita. Se suoritetaan transfektoimalla kantasoluihin liittyviä geenejä kypsiin soluihin käyttäen virusvektoreita , kuten retroviruksia .
Historia
Ensimmäinen henkilö, joka osoitti onnistuneesti uudelleenohjelmoinnin, oli John Gurdon , joka vuonna 1962 osoitti, että erilaistuneet somaattiset solut voitaisiin ohjelmoida uudelleen alkion tilaan, kun hän onnistui saamaan uimakoita sen jälkeen, kun eriytetyt suoliston epiteelisolut siirrettiin enukleoituihin sammakonmuniin. Tästä saavutuksesta hän sai Shinya Yamanakan rinnalla lääketieteen Nobelin vuoden 2012 palkinnon . Yamanaka osoitti ensimmäisenä (vuonna 2006), että tämä somaattisten solujen ydinsiirto tai munasolupohjainen uudelleenohjelmointiprosessi (katso alla), jonka Gurdon löysi, voitaisiin uudelleen (hiirillä) määritettyjen tekijöiden ( lokakuu 4 , Sox2 , Klf4 ja c) perusteella -Myc ) indusoitujen pluripotenttisten kantasolujen (iPSC) tuottamiseksi. Myös muita geenien yhdistelmiä on käytetty.
Vaihtelevuus
Uudelleenohjelmoinnin jälkeen saatujen solujen ominaisuudet voivat vaihdella merkittävästi, erityisesti iPSC: iden kesken. Tekijöitä, jotka johtavat lopputuotteiden uudelleenohjelmoinnin ja toiminnallisten ominaisuuksien vaihteluun, ovat geneettinen tausta, kudoslähde, uudelleenohjelmointitekijästökiometria ja soluviljelmään liittyvät stressitekijät.
Somaattisten solujen ydinsiirto
Munasolun ohjelmoida uudelleen aikuisen tuman sisään alkion tilaan, kun somaattisten solujen siirron , niin että uusi organismi voidaan kehittää tällaisia solun.
Uudelleenohjelmointi eroaa somaattisen epityypin kehityksestä , koska somaattisia epityyppejä voidaan mahdollisesti muuttaa sen jälkeen, kun organismi on poistunut kehitysvaiheesta. Somaattisten solujen ydinsiirron aikana munasolu sammuttaa kudosspesifiset geenit somaattisen solun ytimessä ja kytkee takaisin alkion spesifiset geenit.