Polyklonaaliset vasta-aineet - Polyclonal antibodies

Polyklonaaliset vasta-aineet (pAbs) ovat vasta-aineita , joita erittävät kehossa olevat erilaiset B- solulinjat (kun taas monoklonaaliset vasta-aineet tulevat yhdestä solulinjasta). Ne ovat kokoelma immunoglobuliinimolekyylejä , jotka reagoivat tiettyä antigeeniä vastaan , joista kukin identifioi eri epitoopin .

Tuotanto

Yleinen menetelmä polyklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi on seuraava:

antigeeni valmistelu
Adjuvantin valinta ja valmistus
Eläinten valinta
Injektioprosessi
Veriseerumin uutto

Antigeeni / adjuvanttikonjugaatti injektoidaan valitsemaansa eläimeen monistetun immuunivasteen aloittamiseksi. Tiettyyn aikaan annettujen injektiosarjojen jälkeen eläimen oletetaan luovan vasta-aineita konjugaattia vastaan. Sitten veri uutetaan eläimestä ja puhdistetaan sitten kiinnostavan vasta-aineen saamiseksi.

Ylitys suoritetaan sopivalla nisäkkäällä , kuten hiirellä, kanilla tai vuohella. Suuremmat nisäkkäät ovat usein edullisia, koska seerumin määrä, joka voidaan kerätä, on suurempi. Antigeeni injektoidaan nisäkkääseen. Tämä saa B- lymfosyytit tuottamaan antigeenille spesifisiä IgG- immunoglobuliineja . Tämä polyklonaalinen IgG puhdistetaan nisäkkään seerumista .

Sitä vastoin monoklonaaliset vasta-aineet ovat peräisin yhdestä solulinjasta.

Laboratorioeläimillä on monia menetelmiä polyklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi. Eläinten käyttöä ja näihin menetelmiin liittyviä menettelytapoja koskevat institutionaaliset ohjeet ovat yleensä suuntautuneet inhimillisiin näkökohtiin ja adjuvantin (aineet, jotka muuttavat muiden aineiden vaikutusta, mutta joilla on vain vähän tai ei lainkaan suoria vaikutuksia, kun ne itse antavat) käyttö. Tämä sisältää adjuvanttivalinnan, antoreitit ja -kohdat, injektiotilavuudet per kohta ja kohtausten lukumäärä eläintä kohti. Institutionaalinen politiikka sisältää yleensä sallitut verimäärät keräystä kohti ja varotoimenpiteet, mukaan lukien asianmukainen eläinten pidätys ja sedaatio tai anestesia eläinten tai henkilöstön loukkaantumisen ehkäisemiseksi.

Laboratorioeläinten vasta-ainetuotannon ensisijainen tavoite on saada korkean tiitterin , korkean affiniteetin antiseerumit kokeisiin tai diagnostisiin testeihin käytettäväksi. Adjuvantteja käytetään parantamaan tai tehostamaan immuunivastetta antigeeneille. Useimmat adjuvantit tarjoavat injektiokohdan, antigeenivaraston, joka mahdollistaa antigeenin hitaan vapautumisen tyhjentäviin imusolmukkeisiin.

Monet adjuvantit sisältävät tai toimivat suoraan myös seuraavasti:

- pinta-aktiiviset aineet, jotka edistävät proteiiniantigeenimolekyylien pitoisuutta suurella pinta-alalla, ja -
immunostimuloivat molekyylit tai ominaisuudet. Adjuvantteja käytetään yleensä liukoisten proteiiniantigeenien kanssa vasta-ainetiitterien lisäämiseksi ja pitkittyneen vasteen aikaansaamiseksi mukana olevan muistin kanssa.

Tällaiset antigeenit ovat itsessään yleensä heikkoja immunogeenejä. Useimmat monimutkaiset proteiiniantigeenit indusoivat useita B-soluklooneja immuunivasteen aikana, joten vaste on polyklonaalinen. Adjuvantit ovat yleensä huonosti tai tehostaneet immuunivasteita ei-proteiiniantigeeneihin, eikä järjestelmämuistia ole.

Vasta-aineita tuotetaan tällä hetkellä myös eristämällä ihmisen B-lymfosyyttejä spesifisten rekombinanttien monoklonaalisten vasta-aineseosten tuottamiseksi. Biotekniikkayritys Symphogen kehittää tämäntyyppisiä vasta-aineita terapeuttisiin sovelluksiin. Ne ovat ensimmäinen tutkimusyritys, joka on saavuttanut toisen vaiheen tutkimukset monoklonaalisten vasta-aineseosten kanssa, jotka matkivat polyklonaalisten vasta-ainelääkkeiden monimuotoisuutta. Tämä tuotanto estää viruksen ja prionin leviämisen, ja tämä on yksinkertainen prosessi.

Eläinten valinta

Eläimiin, joita usein käytetään polyklonaalisten vasta-aineiden tuotantoon, kuuluvat kanat, vuohet, marsut, hamsterit, hevoset, hiiret, rotat ja lampaat. Kani on kuitenkin yleisimmin käytetty laboratorioeläin tähän tarkoitukseen. Eläinten valinnan tulisi perustua:

tarvittavan vasta-aineen määrä,
suhde antigeenin luovuttajan ja vastaanottajan vasta-ainetuottajan välillä (yleensä mitä kauempana filogeneettinen suhde on, sitä suurempi on potentiaali korkean tiitterin vasta-ainevasteelle) ja
tarvittavien ominaisuuksien [esim. luokka, alaluokka (isotyyppi), komplementin kiinnittävä luonne] valmistettaville vasta-aineille. Immunisointi ja flebotomiat liittyvät stressiin, ja ainakin kaneja ja jyrsijöitä käytettäessä suositellaan spesifisiä patogeenivapaita (SPF) eläimiä. Tällaisten eläinten käyttö voi vähentää dramaattisesti patogeenisten organismien, erityisesti kaneissa esiintyvän Pasteurella multocidan , aiheuttamaa sairastuvuutta ja kuolleisuutta .

Vuohia tai hevosia käytetään yleensä, kun tarvitaan suuria määriä antiseerumia. Monet tutkijat suosivat kanoja niiden filogeneettisen etäisyyden vuoksi nisäkkäistä. Kanat siirtävät suuria määriä IgY: tä (IgG) munankeltuaiselle, ja vasta-aineiden kerääminen munista eliminoi invasiivisen verenvuotomenettelyn tarpeen. Yhden viikon munat voivat sisältää 10 kertaa enemmän vasta-aineita kuin kanin veren määrä, joka saadaan yhdestä viikoittaisesta verenvuodosta. On kuitenkin joitain haittoja käytettäessä tiettyjä kanasta peräisin olevia vasta-aineita immunomäärityksissä. Kana IgY ei kiinnitä nisäkkään komplementtikomponenttia C1 eikä se toimi saostavana vasta-aineena käyttämällä standardiliuoksia.

Vaikka hiiriä käytetään useimmiten monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseen, niiden pieni koko estää yleensä niiden käytön riittävissä määrissä polyklonaalisia seerumivasta-aineita. Hiirten polyklonaaliset vasta-aineet voidaan kuitenkin kerätä askitesnesteestä käyttämällä mitä tahansa useista vesitulehduksia tuottavista menetelmistä.

Kaneja käytettäessä ensisijaisiin immunisointeihin tulisi käyttää nuoria aikuisia eläimiä (2,5–3,0 kg tai 5,5–6,5 paunaa) voimakkaan vasta-ainevasteen vuoksi. Immuunitoiminnan huippu on murrosiässä ja ensisijaiset vasteet uusiin antigeeneihin vähenevät iän myötä. Naaraspuoliset kanit ovat yleensä edullisia, koska ne ovat oppivampia ja niiden raportoidaan aikaansaavan voimakkaamman immuunivasteen kuin urokset. Vähintään kahta eläintä kutakin antigeeniä kohti tulisi käyttää, kun käytetään vanhoja eläimiä. Tämä periaate vähentää potentiaalista kokonaisvikaa, joka johtuu siitä, että yksittäiset eläimet eivät reagoi antigeeneihin.

Antigeenivalmiste

Proteiiniantigeenien koko, aggregaation laajuus ja suhteellinen natiivi voivat kaikki dramaattisesti vaikuttaa tuotettujen vasta-aineiden laatuun ja määrään. Pienet polypeptidit (<10 ku ) ja ei-proteiiniantigeenit on yleensä konjugoitava tai silloitettava suurempiin, immunogeenisiin kantajaproteiineihin immunogeenisuuden lisäämiseksi ja T- soluepitooppien aikaansaamiseksi. Yleensä mitä suurempi immunogeeninen proteiini, sitä parempi. Suuremmat proteiinit, jopa pienemmissä määrissä, johtavat yleensä antigeeniä esittelevien antigeeniä käsittelevien solujen parempaan sitoutumiseen tyydyttävän immuunivasteen saavuttamiseksi. Liukoisten, aggregoitumattomien proteiinien injektiolla on suurempi todennäköisyys aiheuttaa toleranssi kuin tyydyttävä vasta-ainevaste.

Avaimenreiän limhemosyaniini (KLH) ja naudan seerumialbumiini ovat kaksi laajalti käytettyä kantajaproteiinia. Poly-L-lysiiniä on myös käytetty menestyksekkäästi peptidien runkona. Vaikka poly-L-lysiinin käyttö vähentää tai eliminoi vieraiden proteiinien vasta-aineiden tuotantoa, se voi johtaa peptidien aiheuttaman vasta-aineen tuotannon epäonnistumiseen. Viime aikoina liposomeja on käytetty menestyksekkäästi myös pienten peptidien kuljettamiseen, ja tämä tekniikka on vaihtoehto öljyisten emulsioadjuvanttien kanssa tapahtuvalle luovutukselle.

Antigeenimäärä

Antigeenimäärän valinta immunisointia varten vaihtelee antigeenin ja valitun adjuvantin ominaisuuksien mukaan. Yleensä mikrogrammasta milligrammaan proteiinimäärät adjuvantissa ovat välttämättömiä korkean tiitterin vasta-aineiden herättämiseksi. Antigeeniannos liittyy yleensä lajeihin eikä ruumiinpainoon. Niin kutsuttu immunogeenisuuden "ikkuna" kussakin lajissa on laaja, mutta liian suuri tai liian pieni antigeeni voi aiheuttaa suvaitsevaisuuden, tukahduttamisen tai immuunipoikkeaman soluimmuniteetille pikemminkin kuin tyydyttävän humoraalisen vasteen. Optimaaliset ja tavanomaiset proteiiniantigeenitasot tiettyjen lajien immunisoimiseksi on raportoitu seuraavilla alueilla:

kani, 50–1000 ug;
hiiri, 10–50 ug;
marsu, 50–500 µg; ja
vuohi, 250–5000 µg.

Optimaalisten "aloitus" -annosten ilmoitetaan olevan kunkin alueen alimmassa päässä.

Seerumin vasta-aineiden affiniteetti kasvaa ajan myötä (kuukausia) antigeeni-adjuvanttiseosten injektoinnin jälkeen ja kun antigeeni järjestelmässä vähenee. Laajasti käytetyt antigeeniannokset "tehosteeksi" tai sekundaarisiin immunisointeihin ovat yleensä puolet aloitusannosten suuruudesta. Antigeeneissä ei saa olla preparatiivisia sivutuotteita ja kemikaaleja, kuten polyakryyliamidigeeli, SDS, urea, endotoksiini, hiukkaset ja äärimmäisen pH-arvo.

Peptidivasta-aineet

Kun vasta-aineen tuottamiseen käytetään peptidiä, on erittäin tärkeää suunnitella antigeenit oikein. Suunnittelussa voi olla useita resursseja sekä yrityksiä, jotka tarjoavat tätä palvelua. Expasy on yhteen joukon julkisen työkaluja omalla ProtScale sivu, jotka vaativat jonkin verran käyttäjän tiedon navigoida. Yksinkertaisemmalle peptidien pisteytystyökalulle on saatavana Antigen Profiler -työkalu, jonka avulla voit pisteyttää yksittäisiä peptidisekvenssejä vasta-aineiden tuottamiseen käytettyjen aikaisempien immunogeenien suhteiden epitooppikartoitustietokannan perusteella. Lopuksi peptidien tulisi yleensä noudattaa joitain peruskriteereitä.

Kun tutkitaan peptidejä synteesiä ja immunisointia varten, on suositeltavaa välttää tiettyjä tähteitä ja sekvenssejä mahdollisten synteesiongelmien vuoksi. Tämä sisältää joitain yleisempiä ominaisuuksia:

Erittäin pitkät saman aminohapon toistot (esim. RRRR)
Seriini (S), treoniini (T), alaniini (A) ja Valiini (V) -dubletit
Sekvenssin lopettaminen tai aloittaminen proliinilla (P)
Glutamiini (Q) tai asparagiini (N) n-päässä
Hydrofobisilla tähteillä (esim. V, A, L, I jne.) Painotetut peptidit

Reaktiivisuus

Tutkijoiden tulisi myös ottaa huomioon proteiiniantigeenien syntyvyyden tila, kun niitä käytetään immunogeeneinä, ja reaktio tuotettujen vasta-aineiden kanssa. Natiivien proteiinien vasta-aineet reagoivat parhaiten natiivien proteiinien kanssa ja denaturoitujen proteiinien vasta-aineet reagoivat parhaiten denaturoitujen proteiinien kanssa. Jos kalvopäällysteissä (proteiinit, joille on tehty denaturointiolosuhteet) käytetään vasta-aineita, vasta-aineita tulisi valmistaa denaturoituja proteiineja vastaan. Toisaalta, jos vasta-aineita on tarkoitus käyttää reagoimaan natiivin proteiinin kanssa tai estämään proteiinin aktiivinen kohta, vasta-aineita tulisi valmistaa natiivia proteiinia vastaan. Adjuvantit voivat usein muuttaa proteiinin syntyvyyttä. Yleensä imeytyneet proteiiniantigeenit ennalta muodostetussa öljy-vedessä- emulsiiadjuvantissa säilyttävät suuremman natiiviproteiinirakenteen kuin vesi-öljyssä -emulsioissa.

Aseptisuus

Antigeenit tulisi aina valmistaa tekniikoilla, jotka varmistavat, että niissä ei ole mikrobikontaminaatiota. Suurin osa proteiiniantigeenivalmisteista voidaan steriloida kulkemalla 0,22 um suodattimen läpi. Septisiä paiseita esiintyy usein eläinten rokotuspaikoissa, kun käytetään saastuneita valmisteita. Tämä voi johtaa immunisaation epäonnistumiseen kohdistettua antigeeniä vastaan.

Adjuvantit

On monia kaupallisesti saatavia immunologisia adjuvantteja . Spesifisten adjuvanttien tai tyyppien valinta vaihtelee riippuen siitä, käytetäänkö niitä tutkimuksessa ja vasta-aineiden tuotannossa vai rokotteiden kehittämisessä. Rokotteen käyttöä varten tarkoitettujen adjuvanttien on tuotettava vain suojaavia vasta-aineita ja hyvä systeeminen muisti, kun taas antiseerumin tuotantoon tarkoitettujen aineiden on indusoitava nopeasti korkean tiitterin, korkean aviditeetin vasta-aineita. Yksikään adjuvantti ei ole ihanteellinen kaikkiin tarkoituksiin, ja kaikilla on etuja ja haittoja. Adjuvantin käyttöön liittyy yleensä eri vaikeusasteen ja keston omaavia ei-toivottuja sivuvaikutuksia. Uusien adjuvanttien tutkimus keskittyy aineisiin, joilla on minimaalinen myrkyllisyys säilyttäen samalla maksimaalinen immunostimulaatio. Tutkijoiden tulee aina olla tietoisia mahdollisesta kivusta ja ahdistuksesta, joka liittyy adjuvanttikäyttöön laboratorioeläimissä.

Yleisimmin käytettyjä adjuvantteja vasta-ainetuotannossa ovat Freund, Alum, Ribi Adjuvant System ja Titermax.

Freundin adjuvantit

Freundin adjuvantteja on kaksi perustyyppiä : Freundin täydellinen adjuvantti (FCA) ja Freundin epätäydellinen adjuvantti (FIA). FCA on vesi öljyssä -emulsio, joka lokalisoi antigeenin jopa 6 kuukauden vapautumisjaksoille. Se on formuloitu mineraaliöljyn, pinta-aktiivisen mannidimonoleaatin ja lämpö tapetun Mycobacterium tuberculosis- , Mycobacterium butyricum- tai niiden uutteiden kanssa (makrofagien aggregaatioksi rokotuskohdassa ). Tämä tehokas adjuvantti stimuloi sekä soluvälitteistä että humoraalista immuniteettia vasta-aineen ensisijaisella induktiolla denaturoitujen proteiinien epitooppeja vastaan. Vaikka FCA on ollut historiallisesti eniten käytetty adjuvantti, se on yksi myrkyllisimmistä aineista metaboloitumattoman mineraaliöljyn takia ja se aiheuttaa granulomatoottisia reaktioita. Sen käyttö on rajoitettu laboratorioeläimiin, ja sitä tulisi käyttää vain heikkojen antigeenien kanssa. Sitä ei tule käyttää useammin kuin kerran yhdellä eläimellä, koska useat FCA-rokotukset voivat aiheuttaa vakavia systeemisiä reaktioita ja heikentynyttä immuunivastetta. Freundin epätäydellisellä adjuvantilla on sama formulaatio kuin FCA: lla, mutta se ei sisällä mykobakteeria tai sen komponentteja. FIA rajoittuu yleensä antigeenin tehosteannoksiin, koska se on yleensä paljon vähemmän tehokas kuin FCA primäärisen vasta-aineen indusoinnissa. Freundin adjuvantit sekoitetaan normaalisti yhtä suureen osaan antigeenivalmisteita stabiilien emulsioiden muodostamiseksi.

Ribi-adjuvanttijärjestelmä

Ribi-adjuvantit ovat öljy-vedessä-emulsioita, joissa antigeenit sekoitetaan pieniin määriin metaboloituvaa öljyä (skvaleenia), jotka sitten emulgoidaan suolaliuoksella, joka sisältää pinta-aktiivista ainetta Polysorbate 80. Tämä järjestelmä sisältää myös puhdistettuja mykobakteerituotteita (johdotekijä, soluseinän luuranko). immunostimulaattoreina ja bakteerimonofosforyylilipidi A: na. Adjuvanttijärjestelmästä on saatavana kolme erilaista lajikeskeistä formulaatiota. Nämä adjuvantit ovat vuorovaikutuksessa immuunisolujen membraanien kanssa, mikä johtaa sytokiinien induktioon, mikä parantaa antigeeninottoa, prosessointia ja esittelyä. Tämä adjuvanttijärjestelmä on paljon vähemmän myrkyllinen ja vähemmän tehokas kuin FCA, mutta yleensä indusoi tyydyttävät määrät korkean aviditeetin vasta-aineita proteiiniantigeenejä vastaan.

Titermax

Titermax edustaa uudemman sukupolven adjuvantteja, jotka ovat vähemmän myrkyllisiä eivätkä sisällä biologisesti johdettuja materiaaleja. Se perustuu pinta-aktiivisten aineiden, lineaaristen, ei-ionisten kopolymeerien, polyoksipropeenin (POP) ja polyoksietyleenin (POE), seoksiin tai ketjuihin. Nämä kopolymeerit ovat vähemmän myrkyllisiä kuin monet muut pinta-aktiiviset aineet ja niillä on voimakkaita adjuvanttiominaisuuksia, jotka suosivat kemotaksia, komplementtiaktivaatiota ja vasta-ainetuotantoa. Titermax-adjuvantti muodostaa mikropartikkelisen vesi-öljyssä-emulsion kopolymeerin ja metaboloituvan skvaleeniöljyn kanssa. Kopolymeeri on päällystetty emulsiota stabiloivilla piidioksidihiukkasilla, mikä mahdollistaa suuren määrän monenlaisia antigeenimateriaaleja. Adjuvantti-aktiivinen kopolymeeri muodostaa hydrofiilisiä pintoja, jotka aktivoivat komplementin, immuunisolut ja luokan II tärkeimpien histokompatibiliteettimolekyylien lisääntyneen ilmentymisen makrofageilla. Titermax antaa antigeenin erittäin konsentroidussa muodossa immuunijärjestelmälle, mikä johtaa usein vasta-ainetiittereihin, jotka ovat verrattavissa FCA: n tai sitä korkeammiin.

Specol : Specol on vesi öljyssä -adjuvantti, joka on valmistettu puhdistetusta mineraaliöljystä . Sen on raportoitu indusoivan immuunivastetta, joka on verrattavissa Freundin adjuvanttiin kaneilla ja muilla tutkimuseläimillä tuottamalla vähemmän histologisia vaurioita.

Farmaseuttiset käyttötarkoitukset

Digoksiini Immune Fab on polyklonaalisten vasta-aineiden antigeeniä sitova fragmentti, joka on nostettu Digitaliksen johdannaiseen proteiiniin sitoutuneena hapteenina, ja sitä käytetään hengenvaarallisen digoksiinin tai digitoksiinin toksisuuden kumoamiseen .

Rho (D) -immunoglobuliini valmistetaan yhdistetystä ihmisen plasmasta, jonka Rh-negatiiviset luovuttajat toimittavat vasta-aineilla D-antigeenille. Sitä käytetään antigeenin passiiviseen immuunisitoutumiseen, mikä estää äidin aktiivisen immuunivasteen, joka voi mahdollisesti johtaa vastasyntyneen hemolyyttiseen sairauteen .

Rozrolimupabi on anti- RhD- rekombinantti ihmisen polyklonaalinen vasta-aine, joka koostuu 25 ainutlaatuisesta IgG1- vasta -aineesta, ja sitä käytetään immuunitrombosytopenian purppuran hoitoon ja isoimmunisaation estämiseen Rh-negatiivisilla raskaana olevilla naisilla.

REGN-COV2 ( Regeneron Pharmaceuticals ) - potentiaalinen hoito ihmisille, joilla on COVID-19, ja estämään SARS-CoV-2- koronavirusinfektio.

Edut

Polyklonaalisten vasta-aineiden (PAb) käytöllä monoklonaalisiin vasta-aineisiin verrattuna on etuja. Polyklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseen tarvittavat tekniset taidot eivät ole yhtä vaativia. Niiden valmistaminen on halpaa ja ne voidaan tuottaa melko nopeasti, ja niiden valmistaminen vie jopa useita kuukausia. PAb: t ovat heterogeenisiä, mikä sallii niiden sitoutumisen laajaan valikoimaan antigeeniepitooppeja. Koska PAb: ita tuotetaan suuresta joukosta B-soluklooneja, ne sitoutuvat todennäköisemmin onnistuneesti tiettyyn antigeeniin. PAb: t pysyvät vakaina eri ympäristöissä, kuten pH: n tai suolapitoisuuden muutoksessa, mikä antaa niiden olla soveltuvampia tietyissä menettelyissä. Tarvittavasta määrästä riippuen PAb: itä voidaan lisäksi valmistaa suurina määrinä suhteessa käytetyn eläimen kokoon.

Languages

In other projects